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[目的]1、通过检测人乳腺癌MDA-MB-435细胞系中CD44+CD24-/l0W表型细胞的比例,探讨CD44分子在乳腺癌发生中的作用。2、采用短发夹状RNA(shRNA)干扰技术敲减MDA-MB-435系中CD44,观察其是否抑制人乳腺癌MDA-MB-435细胞系中CD44的表达,以及对MDA-MB-435细胞生物学行为是否产生影响。[方法]1、流式细胞仪检测人乳腺癌MDA-MB-435细胞系中CD44的表达,确定MDA-MB-435细胞系中含CD44+CD24-/low表型细胞的比例。2、本实验采用先前以人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435和原发性乳腺癌组织中表达最高的CD44剪接变异体4(CD44s) mRNA为模板,设计、合成shRNA基因片段,构建特异的shRNA-CD44s质粒表达载体,以乱序siRNA和shRNA-GAPDH质粒表达载体作为对照。3、脂质体法将上述质粒瞬时转染到人乳腺癌MDA-MB-435细胞内,应用体外成球实验、Transwell侵袭小室法和流式细胞技术观察shRNA-CD44s阻断CD44基因表达对MDA-MB-435细胞增殖、黏附、侵袭、细胞周期分布及细胞凋亡的影响。4、在瞬时转染的基础上,通过G418筛选,建立稳定转染的MDA-MB-435细胞系,将未转染的MDA-MB-435细胞系作为空白对照组,实时荧光定量PCR检测各组MDA-MB-435细胞的CD44mRNA表达水平并观察CD44mRNA的表达是否受到抑制,应用体内成瘤实验进一步观察敲减CD44对成瘤能力的影响。[结果]1、流式细胞仪检测显示：用流式细胞术的方法检测人乳腺癌MDA-MB-435细胞,可获得含CD44+CD24-/low表型细胞的比例达到90%以上。2、shRNA-CD44s能明显降低MDA-MB-435细胞中CD44s基因nRNA的表达量,促进乳腺癌MDA-MB-435细胞的凋亡利坏死,调控细胞周期,使细胞侵袭力降低,同时能抑制细胞的增殖、自我更新能力。3、体内成瘤实验显示,在NOD/SCID小鼠胸部皮下注射106个未转染shRNA-CD44s的MDA-MB-435细胞,第21天,注射部位出现质地较硬的结节,然而左侧注射106个转染shRNA-CD44s的MDA-MB-435细胞,第21天,注射部位却未见明显的肿瘤形成。荧光显微镜下观察,未转染组肿瘤组织中有明显红色荧光信号,荧光信号区域分布广泛,说明对照组肿瘤组织中有CD44蛋白的表达；而转染组肿瘤组织中可见到微弱的或几乎见不到的红色荧光信号及绿色的GFP荧光。肿瘤组织石蜡切片HE染色,光镜下见未转染组的肿瘤组织呈条索状排列,未见明显导管分化。中央见大片坏死,细胞体积大,胞浆嗜酸性透亮,细胞核明显增大,深染,病理性核分裂易见,大部分细胞可见明显核仁,局部可见奇异巨细胞,而转染组肿瘤组织大部分细胞体积中等,中央未见坏死。[结论]1、敲减CD44可使乳腺癌细胞的成球能力减弱,提示乳腺癌干细胞干性受到抑制并分化成非乳腺癌干细胞,提示CD44是发挥肿瘤干细胞干性的关键分子。2、敲减CD44可抑制乳腺癌细胞的增殖,调控细胞周期,促进细胞的凋亡和坏死,使细胞侵袭力降低。3、本项目的研究结果为乳腺癌的靶向治疗提供了新依据和线索。