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高山被孢霉(M.alpina)具有很强的脂肪酸合成能力,可以合成包括花生四烯酸(AA)和二十碳五烯酸(EPA)在内的多种多不饱和脂肪酸(PUFAs),在食品工业中具有广阔的开发前景。异柠檬酸脱氢酶(IDH)作为一种基础代谢酶,在生物体内可以发挥多元化功能,影响胞内碳源流向、产生还原力NADPH,对脂质合成具有重要调控作用,是新陈代谢中不可缺少的重要酶类。本文以高山被孢霉的异柠檬酸脱氢酶(MaIDH)为研究对象,构建MaIDH同源过表达菌株。在氮限制培养条件下,对重组菌株在不同发酵时间点的MaIDH的转录水平、酶活及菌体的生长、脂质积累和相关代谢产物的变化情况进行分析,研究不同辅酶依赖型MaIDH在高山被孢霉脂质合成过程中的作用;此外通过构建MaIDH大肠杆菌异源表达菌株获取目的蛋白以研究MaIDH的酶学特性,为全面深入了解MaIDH提供指导。本文为解析高山被孢霉中异柠檬酸脱氢酶的功能及提高高山被孢霉产脂能力提供一定的理论依据和指导,主要研究结果如下:1.通过生物信息学分析发现高山被孢霉中存在6个MaIDH同工酶。对其保守结构域进行分析发现,各MaIDH均属于异柠檬酸脱氢酶超家族,其中MaIDH1/2/3为NAD~+依赖型MaIDH,MaIDH4/5/6为NADP~+依赖型MaIDH。6个MaIDH均无跨膜结构,且不属于分泌蛋白。对高山被孢霉MaIDH同源过表达菌株的转录水平进行分析发现,各重组菌株MaIDH转录水平高于对照组菌株,其转录水平提高1.3倍~34.4倍不等,这表明在高山被孢霉中过表达MaIDH能有效提高MaIDH的转录水平。2.在氮源限制条件下,过表达NAD~+-MaIDH1/2/3导致高山被孢霉重组菌株中总脂含量分别降低3.7%、5.3%和12.5%不等;而在高山被孢霉中过表达NADP~+-MaIDH4/5/6则使得重组菌株中总脂含量分别提高8.2%、1.6%和3.4%不等。其中过表达NAD~+-MaIDH3和NADP~+-MaIDH4对高山被孢霉总脂含量影响相对最为显著。以上结果表明MaIDH各同工酶对高山被孢霉产脂情况的影响不同,NAD~+-MaIDH为负向调控,而NADP~+-MaIDH为正向调控。3.对氮源限制条件下的MaIDH同源过表达菌株进行酶活测定,发现重组菌株中MaIDH的酶活均高于对照菌株,各重组菌株MaIDH酶活随着发酵时间的延长逐渐降低。其中NAD~+依赖型MaIDH中MaIDH3相较于对照组提高37.4%,而NADP~+依赖型MaIDH中MaIDH5相较于对照组提高25.5%。这表明通过干预高山被孢霉MaIDH的转录水平可以进一步在蛋白层面影响高山被孢霉MaIDH的活性。4.对氮源限制条件下的MaIDH同源过表达菌株进行代谢产物分析,结果表明过表达NAD~+-MaIDH1/2/3在高山被孢霉进入脂质积累期时可以显著降低胞内柠檬酸的含量,相较于对照组分别降低52.9%、24.2%和23.9%;而过表达NADP~+-MaIDH4/5/6则可以显著提高高山被孢霉中NADPH的含量,分别提高37.6%、46.2%和30.1%不等。这说明在高山被孢霉中过表达MaIDH可以通过影响TCA循环调控胞内碳通量或影响胞质中NADPH的含量。5.为探究MaIDH的酶学特性,选取对高山被孢霉脂质合成影响效果相对显著的NAD~+-MaIDH3和NADP~+-MaIDH4构建大肠杆菌异源表达菌株。通过诱导表达获取大量目的蛋白且MaIDH4在大肠杆菌中检测到相应活性。测得MaIDH4的最适温度和最适pH分别为35°C和pH 8.0,该酶在温度低于40°C时具有较好的热稳定性,在pH 6.5~8.0的范围内具有较好的pH稳定性。酶学特性的解析有利于优化高山被孢霉工业发酵条件,为通过调控高山被孢霉脂质合成前体物质来调控脂质合成提供理论依据。