论文部分内容阅读
心力衰竭是21世纪最常见的心血管流行病之一。其中近50%的心衰患者属于舒张性心功能不全,表现为射血分数正常或保留的心衰(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF),其5年生存率仅30%。近20年来,与收缩性心衰防治已经取得的进展相比,舒张性心衰的发病率与病死率没有明显减少,其防治形势十分严峻,已成为心衰研究的难点与热点。心肌细胞钙稳态是钙离子分布及时相变化的动态过程,通过兴奋-收缩耦联机制直接影响心肌细胞的舒缩功能。心肌细胞钙稳态异常贯穿于病理状态下心肌代偿性肥厚至舒张功能障碍,再到舒张性功能不全的全过程。蛋白激酶CaMK Ⅱ介导的肌浆网收缩期钙释放及舒张期钙回摄是调节心肌细胞舒缩功能的关键环节,也是潜在的重要干预靶点,目前临床仍缺乏可有效作用于该靶点的药物。不论HFpEF或收缩性心衰,均可出现心悸、气短、乏力疲倦、胸闷、活动后加重,甚至喘息气促等气虚的证候表现,并可伴有唇甲色暗、舌质紫暗、瘀斑、瘀点等血瘀证征象。基于临证经验及证候规律研究,气虚血瘀被认为是HFpEF的基本病机,贯穿于HFpEF发生发展的始终。基于这一认识开展的临床研究证实益气活血方药在改善HFpEF患者气虚血瘀证的同时,可显著改善心脏舒张功能;我们的前期研究也发现益气活血方药可改善压力负荷大鼠左室舒张功能及肥大心肌细胞的舒缩功能,并对钙转运产生良性调节作用。但益气药、活血药或益气活血药不同配伍对HFpEF是否存在不同影响及其相关机制仍需进一步验证。本研究拟通过复制缩窄腹主动脉致压力负荷HFpEF大鼠模型,运用小动物超声、左心室悬浮导管、激光共聚焦技术、Western blot等技术,从整体、组织、细胞及分子水平验证"益气活血药物可能通过调节心肌细胞钙稳态,改善心肌舒张功能,起到延缓甚至阻断舒张功能不全的作用,并且益气活血药物不同配伍之间存在疗效差异"假说的科学性。方法:1.动物造模:采用改良缩窄腹主动脉术复制压力负荷HFpEF大鼠模型。2.分组及给药:除假手术组外,术后各组大鼠随机分为模型组(给予生理盐水),益气组(给予黄芪+党参),活血组(给予丹参+三七),益气活血1:1组(黄芪+党参vs丹参+三七=1:1),益气活血2:1组(黄芪+党参vs丹参+三七=2:1),美托洛尔组。3.检测方法及指标:(1)术后每周记录大鼠一般情况,包括体重、症状、体征、死亡情况;术后4周、12周小动物超声评价左室心功能,包括舒张期左室前后壁厚度,左室内径,左室射血分数,短轴缩短率,二尖瓣口前向血流速E峰与二尖瓣环运动幅度e峰比值;术后12周大鼠跑台检测运动耐力,左心室悬浮导管测量模型大鼠血流动力学参数以评价左室心功能;术后12周处死动物,采静脉血测量血浆血小板凝集速率、纤维蛋白原含量,并取材计算标化心脏重量及肺重量;(2)术后12周处死动物,急性分离左心室心肌细胞,利用激光共聚焦技术检测心肌细胞舒缩功能及钙释放、钙回摄状态;取心肌组织,Western blot法检测钙转运相关蛋白CaMK Ⅱ、PKA、NCX1、PLB(S16)、PLB(T17)、SERCA2a、RyR2 表达水平。结果:(1)模型评价:与假手术组相比,①术后12周,模型大鼠心肌出现间质纤维化及血管周围纤维化,左室前后壁显著增厚(P<0.05),E/e显著增高(平均值大于15)(P<0.05),标化心脏重量、肺重量显著增加(P<0.05),运动耐力下降(P<0.05),舒张期左室压力下降速率-dp/dt降低(P<0.05),左室舒张末期压力增高(静息约12mmHg,负荷约16mmHg)(P<0.05),颈动脉压力明显增高(P<0.05);左室射血分数、短轴缩短率、收缩期左室压力上升速率下降(P<0.05),但射血分数均大于50%,收缩功能尚正常;②模型大鼠心肌细胞舒张期下降速率-d1/dt减慢(P<0.05),收缩期上升速率+d1/dt下降(P<0.05),收缩最大幅度50%时间增加(P<0.05);模型大鼠钙瞬变最大幅度50%时间延长(P<0.05),钙回落50%时间增加(P<0.05),舒张期钙消除时间常数(P<0.05)及钙泄漏增大(P<0.05),钙储备降低(P<0.05),钙转运相关蛋白表达水平异常,表现为CaMK Ⅱ、PKA、NCX1、N/S(NCX1/SERCA2a)表达水平上升(P<0.05),PLB(S16)、PLB(T17)、SERCA2a 表达水平下降(P<0.05)。此外,模型大鼠出现以运动耐力下降为主的气虚证表现(P<0.05)及以纤维蛋白原含量升高为主的血瘀证表现(P<0.05)。(2)益气活血药物对压力负荷HFpEF大鼠标化心肺重量、心肌纤维化、证候主要表现干预作用:术后12周①与模型组比较,各干预组标化心肺重量均降低(均P<0.05);干预组间比较,益气活血1:1组、益气活血2:1组标化心脏重量改善优于活血组(P<0.05),标化肺重量改善益气活血2:1组优于益气组、活血组、美托洛尔组(P<0.05),但益气活血2:1组与益气活血1:1间比较标化心肺重量无差异(P>0.05);②与模型组相比,仅益气活血2:1组可降低模型大鼠心肌组织纤维化评分(P<0.05);③与模型组比较,益气组、益气活血1:1组,益气活血2:1组可改善反映气虚证的力竭距离、力竭时间(P<0.05);干预组间比较,益气活血2:1组力竭距离、力竭时间优于益气组、益气活血1:1组(均P<0.05);只有活血组、美托洛尔组可降低反映血瘀证的纤维蛋白原含量(P<0.05),益气组、益气活血1:1组、益气活血2:1组有降低纤维蛋白原含量的趋势,但无统计学意义(P>0.05);仅活血组降低血小板最大聚集率有统计学差异(P<0.05),其余各干预组均无统计学差异(P>O.05),但显示出下降趋势。(3)益气活血药物对压力负荷HFpEF大鼠左室舒缩功能的干预作用:术后12周,①益气活血2:1组与模型组比较,可显著改善左室射血分数(P<0.05);与模型组比较,益气组、美托洛尔组舒张期左室前后壁厚度降低(P<0.05),活血组各指标无差异(P<0.05),益气活血1:1组、益气活血2:1组不仅可降低舒张期左室前后壁厚度(P<0.05),还可降低E/e比值(P<0.05),但两组间比较无差异(P>0.05);②左心室悬浮导管测定心肌舒张功能—静息状态下,与模型组比较,益气活血2:1组、益气活血1:1组可显著降低左室舒张末期压力(P<0.05),益气活血2:1组可显著增大左室舒张期压力下降速率-dp/dt(P<0.05),且益气活血2:1组改善左室舒张末期压力优于益气活血1:1组(P<0.05);多巴胺负荷状态下,与模型组比较,益气活血2:1组、益气活血1:1组可显著降低左室舒张末期压力、增大-dp/dt(P<0.05);益气活血2:1组改善-dp/dt疗效优于益气活血1:1组(P<0.05)。(4)益气活血药物对压力负荷HFpEF大鼠心肌细胞舒缩功能、钙稳态及钙转运关键蛋白的干预作用:术后12周,①心肌细胞收缩功能—与模型组比较,益气组、益气活血1:1组、益气活血2:1组可显著缩短心肌细胞收缩最大幅度50%的时间(P<0.05);干预组间比较,益气活血1:1组、益气活血2:1组改善心肌细胞收缩最大幅度50%的时间优于益气组(P<0.05),益气活血1:1组、2:1组间无统计学差异(P>0.0.5);舒张功能—与模型组比较,各干预组均可改善心肌细胞舒张50%的时间(P<0.05);干预组间比较,益气活血2:1组改善心肌细胞舒张50%的时间优于益气组(P<0.05);益气活血2:1组、益气活血1:1组、美托洛尔组改善心肌细胞舒张50%的时间优于活血组(P<0.05);益气活血1:1组、2:1组间比较无差异(P<0.05);②心肌细胞钙释放—与模型组比较,活血组、美托洛尔组可降低心肌细胞钙瞬变幅度(P<0.05),益气组、益气活血1:1组、益气活血2:1组可缩短钙瞬变最大幅度50%时间(P<0.05),三组间比较无差异(P<0.05);心肌细胞钙回摄—与模型组相比,益气组、益气活血1:1组、益气活血2:1组对钙回落50%时间、钙消除时间常数Tau值有改善作用(P<0.05),三组间比较无差异(P<0.05);活血组、美托洛尔组各指标无统计学差异(P>0.05));钙泄漏及钙储备:与模型组相比,仅益气活血2:1组可减少心肌细胞钙泄漏(P<0.05);各组与模型组比较钙库储备均无差异(P>0.05);③钙转运关键蛋白表达水平:与模型组比较,各干预药物均可降低钙转运关键蛋白CaMK Ⅱ、PKA的表达水平及NCX1/SERCA2a(N/S)比值(P<0.05),仅益气活血2:1组可降低钙释放相关蛋白RyR2的表达并升高钙回摄相关蛋白SERCA2a的表达(P<0.05)),益气组、益气活血1:1组、益气活血2:1组可降低NCX1的表达水平(P<0.05),益气组、益气活血2:1组还可升高钙回摄相关蛋白PLB(S16)、PLB(T17)的表达水平(P<0.05),美托洛尔组可升高PLB(T17)表达水平(PP<0.05);干预组间比较,益气活血2:1组改善CaMK Ⅱ、PKA优于益气组,改善N/S水平优于活血组、美托洛尔组(P<0.05)),其余各干预组间未见明显差异(P>0.05)。结论:1.益气组在改善运动耐力、左室重构、左室舒张功能、心肌细胞舒缩功能、钙回摄及升高PLB磷酸化位点的表达量方面优于活血组。2.整体上,益气活血配伍组防治舒张性心功能不全疗效优于单纯的益气、活血和美托洛尔组。3.重用益气药物的益气活血配伍组防治舒张性心功能不全疗效优于常规益气活血配伍组。