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背景和目的肺癌患者确诊时,大多数患者已经发生远处转移。非小细胞肺癌(non-small-cel l-lung cancer,NSCLC)患者中骨转移的发生率高达40%左右。严重的骨转移患者会发生骨相关事件(skeletal-related events,SREs),明显缩短患者的生存时间。前期基础研究发现,钙磷蛋白(calcyphosine,CAPS1)与NSCLC骨转移的发生密切相关。首先,CAPS1在NSCLC骨转移组织中高表达;其次,CA PS1在低骨转移潜能非小细胞肺癌细胞中表达明显低于骨转移潜能较高的细胞;最后,CAPS1的表达量与NSCLC细胞的侵袭迁移能力呈正相关。通过NSCLC骨转移患者骨穿刺标本,使用Western blot技术,发现CAPS1、AKT、mTOR蛋白在NSCLC骨转移组织中有表达。除此之外,有一些研究发现CAPS1具有以下一些特点:(1)CAPS1与钙调蛋白(calmodulin,CaM)在氨基酸序列和拓扑结构上的存在高度的一致性;(2)CAPS1是一种依赖于环腺苷酸(cAMP)蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)磷酸化的底物;(3)钙/钙调蛋白(Ca2+/CaM)可能参与丝苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase,AKT)的激活并促进AKT的活化。因此,我们认为CAPS1可能通过环腺苷酸-蛋白激酶A(cA MP/PKA)信号系统通路和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白[phosphatidylinositol-3-kinase(PI3K)/protein kinase B(Akt)/the mammalian t arget of Rapamycin(mTOR),PI3K/Akt/mTOR]信号通路促进NSCLC骨转移的发生。本研究拟进一步阐明CAPS1在这两条通路中的潜在作用机制及对NSCLC细胞侵袭迁移能力的影响。材料和方法1、取NSCLC骨转移组织标本,通过Western blot技术,检测CAPS1、AKT、mTOR蛋白在NSCLC骨转移组织中的表达情况;2、构建慢病毒包装的CAPS1过表达载体,构建筛选CAPS1稳定过表达的细胞株(高表达CAPS1的A549细胞株,A549-CAPS1);3、准备好需要的细胞株,针对两条通路设置如下分组:Forskolin处理组为A549细胞、A549细胞+Forskolin处理、A549-GFP细胞、A549-GFP细胞+Forskolin处理、A549-CAPS1细胞、A549-CAPS1细胞+Forskolin;PI3K抑制剂(LY294002)处理组为A549细胞、A549细胞+PI3K抑制剂(LY294002)处理、A549-GFP细胞、A549-GFP细胞+PI3K抑制剂(LY294002)、A549-CAPS1细胞、A549-CAPS1细胞+PI3K抑制剂(LY294002);4、使用cAMP酶免疫测定试剂盒检测Forskolin处理组6株细胞内cAMP的含量变化情况;5、采用Western blot方法检测Forskolin处理组细胞中CAPS1、E-adherin、Vimentin蛋白水平表达情况;6、采用Western blot方法检测PI3K抑制剂处理组细胞中CAPS1、E-adherin、Vimentin、总AKT、总mTOR蛋白水平表达情况;7、利用Transwell实验方法检测经过不同处理的两组细胞体外侵袭等能力的变化情况以及侵袭能力的变化与CAPS1表达量的变化是否具有相关性,以在体外观察CAPS1在非小细胞肺癌细胞株中的生物学作用。结果1、Western blot实验验证了CAPS1、AKT、mTOR在NSCLC骨转移组织中均有表达;2、CAPS1在非小细胞肺癌骨转移组织中表达显著上调;3、成功构建稳定高表达CAPS1的A549细胞株(A549-CAPS1);4、在Forskolin处理组细胞中,使用Forskolin处理过的细胞比未处理过的细胞内cAMP的含量明显升高,每组接受处理的细胞之间的cAMP的含量差异无统计学意义。这说明Forskolin能够明显增加细胞内cAMP的含量。在Forskolin处理组中,接受Forskolin处理过的A549-CAPS1细胞的侵袭迁移能力明显强于其他细胞株、CAPS1蛋白表达明显增加、E-adherin蛋白表达明显增加,同时Vimentin蛋白的表达明显下降。这一结果可能提示:在CAPS1过表达的NSCLC细胞株内cAMP含量的增加与细胞内CAPS1蛋白表达量以及细胞的侵袭迁移能力呈正相关;5、PI3K抑制剂处理组细胞中使用PI3K抑制剂处理的A549-CAPS1细胞侵袭迁移能力明显弱于未处理的A549-CAPS1细胞以及其他两株使用PI3K抑制剂处理的细胞;使用PI3K抑制剂处理的A549-CAPS1细胞中CAPS1蛋白表达明显减少、E-adherin蛋白表达明显减少、总AKT蛋白表达量明显减少、总mTOR蛋白的表达量明显减少以及Vimentin蛋白的表达明显增加。以上结果可能提示:在CAPS1过表达的NSCLC细胞株经PI3K抑制剂处理之后细胞内CAPS1蛋白表达量减少以及细胞的侵袭迁移能减弱。结论CAPS1可促进非小细胞肺癌骨转移发生,且其分子机制可能与cAMP/PKA/MAPK通路和PI3K/AKT/mTOR通路有关。