论文部分内容阅读
母猪繁殖性能对于养猪业来说至关重要。妊娠母猪背膘过厚往往会导致繁殖性能的下降与胎盘功能的紊乱。本文旨在研究母猪高膘妊娠对胎盘绒毛脂肪沉积的影响,同时分离培养猪胎盘绒毛滋养层细胞,研究功能性蛋白Mark4对高膘妊娠母猪胎盘绒毛滋养层细胞脂肪沉积的作用及其调控机制,试验分为三个部分:1母猪高膘妊娠对胎盘绒毛脂肪沉积的影响本研究旨在探讨母猪高膘妊娠对胎盘绒毛脂肪沉积的影响。以纯种长白经产母猪为动物模型,根据背膘厚度分为背膘适中组(12-17 mm)24头和高膘妊娠组(20-27 mm)22头。同时记录母猪分娩后总产仔数、活仔数、木乃伊胎数、死胎数以及初生窝重,采集并检测母血和仔猪脐带血血液生化指标,并检测分娩后胎盘绒毛组织中甘油三酯、胆固醇以及游离脂肪酸含量,胎盘绒毛组织进行油红O染色以观察脂滴含量,同时检测胎盘绒毛脂代谢相关基因FASN1、ACCα、ACSL1、SCD、ATGL和HSL的mRNA表达水平,脂代谢关键转录因子PPARα、PPARγ、SREBP-1c、C/EBP以及Mark4、AMPK的mRNA和蛋白表达水平。结果表明:高膘妊娠组的总产仔数、活仔数和初生窝重均显著低于背膘适中组(P<0.05)。高膘妊娠组母血甘油三酯含量显著高于背膘适中组(P<0.05),而高密度脂蛋白含量显著低于背膘适中组(P<0.05)。油红O染色结果显示高膘妊娠组的胎盘绒毛组织中脂滴含量明显高于背膘适中组,同时高膘妊娠组的胎盘绒毛组织甘油三酯、胆固醇及游离脂肪酸含量均显著高于背膘适中组(P<0.05)。高膘妊娠组胎盘绒毛FASN1、ACCα和ACSL1的mRNA表达水平均显著高于背膘适中组(P<0.05),而ATGL的mRNA表达水平的显著低于背膘适中组(P<0.05)。高膘妊娠组胎盘绒毛C/EBPα的mRNA表达水平显著高于背膘适中组(P<0.05),PPARy的mRNA和蛋白表达水平显著低于背膘适中组(P<0.05),SREBP-1的蛋白水平极显著高于背膘适中组(P<0.01)。另外,高膘妊娠组胎盘绒毛Mark4的mRNA和蛋白表达水平均显著高于背膘适中组(P<0.05),p-Mark4的蛋白表达水平显著高于背膘适中组(P<0.05);AMPK的mRNA和蛋白表达水平均显著低于背膘适中组(P<0.05)。结论:母猪高膘妊娠可引起母猪繁殖性能下降和血脂升高,并促进胎盘绒毛脂肪沉积增加和生脂基因表达的上调。2猪胎盘绒毛滋养层细胞体外原代培养本研究旨在建立一种简便有效的猪胎盘绒毛滋养层细胞体外分离纯化方法。采用胰酶-DNase I酶联合消化法消化母猪自然分娩后胎盘绒毛组织,以35%、45%2个Percoll密度梯度法进行猪胎盘绒毛滋养层细胞的分离纯化,并通过观察细胞形态、测定生长曲线、免疫荧光染色、透射电镜等鉴定猪胎盘绒毛滋养层细胞。结果表明,分离培养的猪胎盘绒毛滋养层细胞呈上皮样平铺成片生长,形态为多角形或类圆形,培养48 h后部分细胞开始融合成多核合胞体滋养层细胞。免疫荧光染色结果显示,细胞角蛋白7染色阳性者占91%以上,表明分离获得的猪胎盘绒毛滋养层细胞纯度较高。透射电镜观察显示所获细胞具有典型滋养层细胞结构特征。综上表明,采用胰酶-DNase I酶联合消化法和35%、45%2个Percoll密度梯度法进行分离纯化,可简便有效地获得较高纯度的猪胎盘绒毛滋养层细胞。3 Mark4对脂毒性条件下猪胎盘绒毛滋养层细胞脂肪沉积的影响及机制本研究旨在探讨Mark4对脂毒性条件下猪胎盘绒毛滋养层细胞脂肪沉积的影响及机制。首先,在细胞培养基中分别添加0μM,50μM,100μM,200μM,400 μM和500 μ脂肪酸混合物,通过油红O染色筛选脂肪酸体外诱导猪胎盘滋养层细胞脂毒性(脂肪沉积)的最佳浓度。同时,通过Real-time PCR筛选Mark4基因干扰载体,并检测超表达效率及干扰效率。然后在脂毒性条件下,超表达或干扰Mark4基因,检测猪胎盘绒毛滋养层细胞中甘油三酯含量、β-catenin及脂代谢关键基因ACCα、FASN1、ACSL1和PPARδ的转录水平。另外,在超表达或干扰Mark4基因的同时,分别添加JW74(Wnt抑制剂)或BML-284(Wnt激活剂),检测细胞中甘油三酯含量、β-catenin及脂代谢关键基因ACCα、FASN1、ACSL1和PPARδ的转录水平。结果表明,400 μM为诱导猪胎盘滋养层细胞脂毒性的最佳浓度。在猪胎盘绒毛滋养层细胞中,超表达Mark4基因显著提高了猪胎盘绒毛滋养层细胞中甘油三酯含量(P<0.05),并促进 β-catenin 及生脂基因 ACCα、FASN1、ACSL1 的表达(P<0.01),而干扰Mark4基因则显著降低了细胞中甘油三酯含量(P<0.05),并抑制β-catenin及生脂基因ACCα、FASN1、ACSL1的表达(P<0.05);另外,在超表达Mark4的同时添加JW74,导致甘油三酯含量下降(P<0.05),β-catenin及生脂基因ACCα、FASN1、ACSL1表达降低(P<0.05),而在干扰Mark4基因的同时添加BML284,导致甘油三酯含量增加(P<0.01),β-catenin及生脂基因ACCα、FASN1、ACSL1表达升高(P<0.01)。由此可见,Mark4可以通过活化Wnt/β-catenin信号通路来介导脂毒性条件下猪胎盘滋养层细胞脂肪沉积。