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樱桃(Cerasus pseudocerasus)为蔷薇科樱属落叶果树,营养价值高,经济效益好,但其根系浅,在栽培过程中易发生涝害,影响其经济收益,因此,进行樱桃耐涝性的遗传改良与种质创新具有重要的理论和实践意义。本实验室前期以筛选到的耐涝樱桃种质‘沂蒙山樱’(Prunus serrulata’Yimeng’)为试材,克隆获得了PsER 与PsCIPK两个基因,发现它们可能参与调控樱桃的耐涝性。本文在此基础上,进一步构建基因的过表达载体和RNAi载体,并采用农杆菌介导的遗传转化法将2个基因转入模式植物拟南芥中,获得纯合转基因阳性植株,并通过淹涝胁迫处理,观察比较其表型变化,测定转基因和野生型植株中碳水化合物代谢相关酶活性的变化规律,为深入揭示樱桃耐涝的分子机理提供理论依据,并为下一步利用基因工程培育耐涝樱桃新种质奠定基础。主要研究结果如下:(1)克隆了樱桃耐涝相关PsERF和PsCIPK基因。提取樱桃‘沂蒙山樱’叶片总RNA,反转录合成cDNA第一链,根据Genebank中PsERF和PsCIPK基因的序列设计引物,克隆获得了两个目的基因的全长序列,均包含完整编码区,且推测氨基酸序列与NCBI数据库中登录的PsERF和PsCIPK基因的氨基酸序列相似性均为100%。(2)构建了 PsERF和PsCIPK基因的过表达载体和PsERF基因的RNAi表达载体。在扩增获得带有合适酶切位点的编码区后,用BglⅡ单酶切目的基因PsERF和双元表达载体pCAMBIA1304,用Nco Ⅰ单酶切目的基因PsCIPK和双元表达载体pCAMBIA1304,用Asc Ⅰ和Swa Ⅰ正向双酶切目的基因PsERF和RNAi表达载体pFGC5941,用Spe Ⅰ和BamHⅠ反向双酶切目的基因PsERF和第一步获得的带有正向目的基因的RNAi表达载体pFGC5941-PsERF-正向,胶回收、连接目的片段与载体后,成功构建植物过表达载体pB1304-PsERF、pB1304-PsCIPK和 RNAi 表达载体 pFGC5941-PsERF-RNAi,空载 pB1304和pG5941。测序验证正确后,采用冻融法将重组质粒以及空载体转化农杆菌EHA105,获得了可以用于遗传转化的农杆菌转化子。(3)获得了纯合的转PsERF、PsCIPK基因拟南芥。利用农杆菌介导的Floral-dip法把目的基因PsERF、PsCIPK和空载导入拟南芥,经过T1代抗性筛选、GUS组织化学染色、T2和T3代分离比筛选,最终筛选得到过表达T3代纯合PsERF转基因拟南芥株系9个,过表达PsCIPK转基因拟南芥株系16个,沉默表达PsERF转基因拟南芥株系5个,纯合空载体对照株系各3个。GUS染色、PCR鉴定及qRT-PCR分析显示,纯合转基因拟南芥均能在基因组中检测到目的基因,过表达转基因拟南芥相对于对照组在转录水平表达水平明显提高,沉默表达转基因拟南芥与对照相比表达明显下调。(4)比较分析了转基因与野生型拟南芥的表型。对转基因拟南芥株系的表型分析发现,过表达PsERF、PsCIPK基因的拟南芥根系明显比野生型长。进行2周的淹涝胁迫处理发现,过表达樱桃PsERF、PsCIPK基因能够增强拟南芥的耐涝性,而沉默PsERF基因使植株的耐涝性减弱,表现出提前枯死的现象。(5)测定了淹涝胁迫对野生型和转基因拟南芥碳水化合物代谢相关酶活性的影响。以野生型为对照,对5周龄转基因拟南芥植株进行淹涝胁迫处理0d、1d、2d、3d、4d、5d,并测定碳水化合物代谢相关蔗糖合成酶(SUS)、α-淀粉酶(RAMY)、乙醇脱氢酶(ADH)、丙酮酸脱羧酶(PDC)以及可溶性蛋白质含量的变化。结果发现,淹涝胁迫过程中,过表达PsERF基因的拟南芥叶片中SUS、RAMY、ADH和PDC酶活性均明显高于对照组和野生型,表明其可通过调整植株糖代谢来抵抗淹涝胁迫,减少淹涝带来的损害。而过表达PsCIPK基因的拟南芥叶片中糖代谢相关酶活性的变化与过表达PsERF基因的变化趋势基本相反。因此,我们认为,PsERF基因可能是调控‘沂蒙山樱’耐涝性的关键基因。