内向整流性钾离子通道（Kir）是一类在多种组织中广泛分布的钾离子通道，自1993年克隆了第一个Kir通道至今，已经发现有约20个成员，构成了一个由七个亚家族（Kir1.x-Kir7.x）组成的超家族。Kir 通道的共同特点是它们的内向整流特性，即钾离子内流较外流容易得多。这一特点使其在维持细胞正常兴奋性、保持血钾平衡等方面起发挥重要的生理作用。同时各亚家族Kir通道在功能上也有各自的特点，如：Kir1.x主要表达于肾脏上皮细胞，它们对细胞内pH在生理范围的变化非常敏感，酸性条件可使该通道关闭，而碱性条件使其开放，在肾小管上皮细胞H+和K+的分泌过程中起重要作用；Kir2.x主要表达于心脏、骨骼肌和神经系统，其电流表现很强的内向整流特性，它在维持心脏及脑组织的兴奋性方面有重要的意义；Kir3.x表达于心血管和神经组织中，它的特点是功能受G蛋白的调节，某些G蛋白偶联受体可通过影响Kir3.x的功能影响心肌细胞、神经细胞和神经内分泌细胞的兴奋性； Kir6.x和SUR（磺酰脲受体）亚单位共同构成ATP敏感的Kir通道（KATP），细胞内核苷酸可以调节其功能，它参与调节胰岛素的分泌和心肌及脑组织在缺血状态下的保护性反应；Kir4.x、Kir5.x和Kir7.x的功能尚不十分清楚。近来的研究发现所有Kir通道有一共同特点即它们的功能均依赖于一种膜磷脂——磷酸肌醇（4，5）二磷酸（PIP2），另外Kir通道的功能还可受细胞内外其它多种因素的调节，而各种Kir通道受这些因素调节的情况并不相同。本实验以非洲爪蟾卵母细胞和培养的COS-7细胞株为表达系统，在细胞中表达了不同Kir通道及与Kir调节有关的调节蛋白，对Kir通道受多种因素的调节情况以及PIP2在这些调节中所起的作用进行了研究。一、在爪蟾卵母细胞中表达内向整流性钾离子通道及内向整流性钾离子通道的电流特性目的：在非洲爪蟾的卵母细胞中表达内向整流性钾离子通道。研究内向整流性钾离子通道的电生理学特性。方法：(1) cRNA的体外转录：所有的Kir通道均克隆到质粒载体<WP=5>pGEMHE中，其序列经测序验证。用适当的限制性内切酶将质粒线性化后，用RibomaxTM Large Scale RNA Production Systems-SP6 and T7 Kit 体外转录得来各种Kir通道的cRNA。(2)爪蟾卵母细胞的分离：在爪蟾冰冻麻醉状态下，下腹部剪开一约0.5 cm的小口，取出卵母细胞。在含2mg/ml胶原酶的OR2液中振荡消化1.5-2小时，OR2液的成分为（mM）NaCl 82.5， KCl 2，MgCl2 1，HEPES 5（pH=7.4）。待细胞消化为单细胞后用ND96液清洗细胞。（3）爪蟾卵母细胞的RNA注射：将各种离子通道cRNA根据其表达情况按每个卵母细胞0.5-10 ng/50 nl注射，注射后的细胞在含2.5 mM丙酮酸钠的ND96中19-20℃培养, ND96溶液构成为 (mM): NaCl 96，KCl 1, CaCl2 1.8, MgCl2 1, HEPES 5, pH 7.4。（4）用双电极电压钳（two-microelectrode voltage clamp，TEVC）方法检测各种Kir通道在卵母细胞中的表达情况和电流特性。结果：（1）质粒DNA的酶切线性化电泳分析：用合适的限制性核酸内切酶在插入片断的下游将环状的质粒DNA线性化，用常规琼脂糖凝胶电泳分析线性化结果。环状质粒电泳显示两条或两条以上的泳带；而线性化完全的质粒DNA电泳显示一条泳带，通过该泳带的电泳位置与DNA质量标准Marker对照可粗略得出该质粒DNA的分子量。（2）体外转录RNA的电泳分析：由于RNA本身有比较稳定的二级结构，所以用常规的琼脂糖凝胶电泳所得到的一般为多条模糊的泳带。我们用甲醛和去离子甲酰胺共同作用使RNA变性以破坏其二级结构，此时再用常规的琼脂糖凝胶电泳方法可得到一条清晰的RNA条带，其分子量可与RNA分子量Marker 对照得出。（3）电生理实验结果：向卵母细胞注射RNA后的第2~3天，即可用TEVC方法检测到Kir电流。以Kir2.1为例，钳制电压为-100mV (或-120mV) 逐渐变至+80mV，当灌流液为高钾的ND96K液时，从所表达Kir电流的电压电流曲线可以看出Kir通道的内向电流较大且随着电压增加而增大，而外向电流很小且没有明显的电压依赖性。Kir通道的内向与外向电流转换时的电流为零，此时的电位为反转电位，反转电位为的位置与细胞外的钾离子浓度有关。在高钾ND96K溶液灌流的情况下，其反转电位接近0 mV；在低钾ND96溶液灌流的情况下，反转电位接近-90mV，与两种钾离子浓度下用Nerst方程所计算的钾平衡电位一致。用钾通道的阻断剂BaCl2可以阻断所表达的Kir电流。同样，在爪蟾卵母细<WP=6>胞中表达其它种类的Kir通道也具有以上同样的电生理特性（结果未显示）。结论：以爪蟾卵母细胞为表达系统，将体外转录得来的RNA以微注射方式注入卵母细胞可表达Kir通道。用双电极电压钳方法可观察卵母细胞内表达Kir通道的电生理特性：（1）Kir 通道电流的内向整流性，即钾离子由细胞外向细胞内流较由细胞内向细胞外流容易。（2）Kir通道电流的反转电位与细胞外钾离子浓度有关，即与钾离子的平衡电位有关。（3）Ba2+可通过与Kir通道的孔区结合而阻断Kir通道的钾电流。二、细胞内pH降低对内向整流性钾离子通道功能的调节 目的：以代谢抑制剂AzideNa(叠氮钠)及KHCO3(碳酸氢钾)降低细胞内的pH，研究细胞内pH降低对Kir2.1、Kir2.3和Kir3