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多不饱和脂肪酸(PUFA)可分为ω-3和ω-6系列脂肪酸在体内具有广泛的生理功能和生物学效应。人体ω-3和ω-6PUFA的比例失衡可以引起一些疾病和生理机能失调。线虫fat-1基因表达的ω-3脂肪酸去饱和酶可以将ω-6PUFA转化为ω-3PUFA，具有重要的医学和营养学价值。本课题拟用分子生物学技术构建原核表达载体，使线虫fat-1基因在大肠杆菌中表达，并对该表达产物的酶学活性做初步的探讨，为进一步开展ω-3脂肪酸去饱和酶的体外酶学研究奠定基础。
[方法]扩增纯化含有线虫fat-1基因的pUC18质粒和原核表达载体pET32a(+)。采用双酶切插入的方法，构建fat-1基因的原核定向表达载体pET32a-fat-1，并采用酶切试验和DNA测序分析鉴定重组结果。用经过鉴定的pET32a-fat-1转化大肠杆菌DE3，采用RT-PCR方法检测fat-1基因在大肠杆菌DE3中的转录活性；以ω-6PUFA为底物培养含有重组质粒的大肠杆菌DE3，采用IPTG诱导fat-1基因的表达，并采用气相色谱质谱法分析大肠杆菌中脂肪酸的组分及其含量变化，从而分析检测表达的ω-3脂肪酸去饱和酶活性。
[结果]
(1)将扩增菌DH5a中的重组质粒pET32a-fat-1抽提和纯化后，酶切鉴定和DNA测序的结果表明，构建的fat-1基因原核表达载体pET32a-fat-1与理论值相符；
(2)将纯化的重组质粒转化大肠杆菌DE3表达菌株，RT-PCR半定量分析测定结果显示，在大肠杆菌DE3中的重组质粒pET32a-fat-1可以转录出fat-1的mRNA，并且转录活性随IPTG诱导浓度的改变而改变；
(3)采用气相色谱质谱法分析的结果显示，以ω-6PUFA为底物培养含有重组质粒的大肠杆菌DE3，经IPTG诱导后，大肠杆菌中有ω-3PUFA的产生，并且ω-3PUFA的含量随着IPTG诱导时间、培养温度和底物ω-6PUFA的不同而不同。
[结论]通过双酶切定向克隆的方法成功构建了fat-1基因的原核定向表达载体pET32a-fat-1，以此表达载体转化进大肠杆菌DE3表达菌株，以ω-6PUFA为底物培养含有重组质粒的大肠杆菌DE3，一经IPTG诱导即可以表达出将ω-6PUFA转化为ω-3PUFA的有活性的线虫ω-3脂肪酸去饱和酶。
线虫fat-1基因在大肠杆菌的成功表达，可为进一步在体外开展ω-3脂肪酸去饱和酶的酶学研究奠定下良好的基础。