论文部分内容阅读
背景:胰腺癌(Pancreatic cancer,PC)在消化系统中属于恶性程度很高的肿瘤。早期胰腺癌由于其非典型的临床症状以及早期筛查指标缺乏特异性,通常难以诊断,从而失去了进行根治性手术切除的机会。而晚期胰腺癌对临床放射疗法和化学疗法的敏感性较低,而且放化疗副作用对病人身体影响较大,胰腺癌患者的预后很差。我们想通过提高抗肿瘤药物的靶向性,从而提高抗肿瘤药物对胰腺癌的疗效并降低对机体正常细胞的损伤。在靶向性问题上,我们利用噬菌体展示技术进行筛选。在抗肿瘤药物上,我们选择了KLA((KLAKLAK)2)凋亡肽作为治疗肽段,KLA凋亡肽段与化学治疗药物相比,具有分子量小、肿瘤穿透能力强、免疫原性低、生物相容性好、毒性作用小、易于合成和修饰等优点[12-13],是理想的抗肿瘤药物。但KLA凋亡肽很难透过细胞膜,无法进入细胞后就不能破坏线粒体膜以诱导细胞凋亡[16]。因此本研究旨在通过利用噬菌体展示技术,筛选出能特异性作用于胰腺癌细胞的靶向肽段。利用该肽段的靶向性,实现对胰腺癌的影像学诊断。并利用该肽段结合凋亡肽段KLA,以期实现融合肽段对胰腺癌细胞具有靶向性并对胰腺癌细胞及肿瘤的生长有抑制作用,并对其相关作用机制进行探讨。方法:本研究选取人源胰腺癌细胞系PANC-1作为靶细胞。首先,我们利用噬菌体展示技术筛选出靶向PANC-1细胞的噬菌体。接着,将筛选到的噬菌体进行扩增后、DNA提取,然后测序。通过与试剂盒提供的简要遗传密码表进行比对,推算出氨基酸序列。利用得到的氨基酸序列合成靶向肽段HMNPWSD,用异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记,并与PANC-1细胞共孵育后,利用细胞免疫荧光实验及流式细胞仪对其靶向性进行了评估。然后,将靶向肽段HMNPWSD与KLA肽段进行了共轭,并再次利用细胞免疫荧光实验及小动物活体成像系统(In vivo imaging system,IVIS)对融合肽段HMNPWSD-KLA进行了体外细胞及体内肿瘤的靶向性评估实验。我们通过MTT法检测了HMNPWSD-KLA融合肽段对PANC-1细胞增殖功能的影响;并利用流式细胞凋亡分析、Western Blot以及线粒体膜电位评估等方法对其抑制PANC-1细胞生长机制进行了研究。最后我们建立了荷载PANC-1肿瘤的裸鼠模型,然后,通过动物实验观察了融合肽段HMNPWSD-KLA在体内对PANC-1肿瘤生长影响。并通过裸鼠器官组织切片及相关血液指标对融合肽段HMNPWSD-KLA的副作用进行了评估。结果:我们通过噬菌体展示技术筛选到的靶向PANC-1细胞的肽段HMNPWSD,细胞免疫荧光实验及流式细胞荧光分析实验结果验证了其对PANC-1细胞具有特异性。细胞免疫荧光及IVIS实验结果证实了融合肽段HMNPWSD-KLA对PANC-1细胞及肿瘤的靶向性。MTT法证实了融合肽段对PANC-1细胞的生长增殖抑制作用。流式细胞凋亡分析、Western Blot以及线粒体膜电位评估等结果证实了对其抑制PANC-1细胞生长机制是通过破坏细胞线粒体,诱导细胞凋亡。利用融合肽段HMNPWSD-KLA作用于荷载PANC-1肿瘤的裸鼠模型实验结果证明了融合肽段对PANC-1肿瘤生长起到明显抑制作用。此外,通过检测裸鼠的器官组织切片及血液学参数证明融合肽段对裸鼠机体影响不大。结论:融合肽段HMNPWSD-KLA对胰腺癌细胞系PANC-1细胞及肿瘤具有靶向特异性,而且该融合肽段通过破坏PANC-1细胞线粒体,诱导细胞凋亡,对细胞及肿瘤的生长起到了明显抑制作用。此外,该融合肽段对于裸鼠重要器官及血液学参数影响不大。