论文部分内容阅读
目的:基于聚酰胺-胺树状大分子(PAMAM),制备还原、pH双重敏感的纳米载体PSSP,用于联合携载化疗药物阿霉素(DOX)及耐药逆转剂依克立达(ELC),同时对其逆转乳腺癌多药耐药的效果进行体内外评价。方法:本文采用氢谱(1H NMR)、红外光谱(FTIR)对载体PSSP进行结构表征。利用疏水作用同时负载DOX和ELC制备联载药纳米粒PSSP/DOX/ELC,并对其进行粒径、电位、包封率和载药量的表征。通过透析袋法考察纳米粒的体外释放行为。以MCF-7(对DOX敏感)和MCF-7/ADR(对DOX不敏感)的人乳腺癌细胞为主要的模型细胞,通过MTT法分别测定空白载体、游离ELC、PSSP/DOX和PSSP/DOX/ELC纳米粒的细胞毒性,计算相应的IC50、耐药倍数和逆转因子。通过激光共聚焦(CLSM)、流式细胞仪和酸化异丙醇萃取法对载药纳米粒的摄取情况进行定性及定量分析。选取代表性的抑制剂考察细胞摄取机制,并通过还原、酸抑制剂考察纳米粒在细胞内的释药情况。以P-gp的自然底物罗丹明123为模型药,利用流式细胞术考察ELC在细胞内的起效浓度以及对药物外排的抑制效果。利用ATP检测试剂盒及流式细胞术进一步考察ELC的作用机制。载药纳米粒的体内抗肿瘤实验在MCF-7荷瘤裸鼠的体内进行的,并采用HE染色的方法考察肿瘤和主要器官的病理变化。结果:1H NMR和FTIR结果显示,载体PSSP成功合成。制备的不同DOX:ELC摩尔比的纳米粒粒径在10~20 nm之间,Zeta电位在+2~5 mV之间。所制备的纳米粒具有较高的包封率,同时负载两药时DOX载药量在10%左右,ELC也可达到2%左右。PSSP/DOX/ELC纳米粒中两药体外同时释放呈现明显的还原、pH敏感性。空白载体和游离ELC无明显的细胞毒性。与PSSP/DOX相比,PSSP/DOX/ELC联载纳米粒表现出较强的细胞毒性和多药耐药的逆转效果,细胞摄取实验结果同样表明PSSP/DOX/ELC的摄取显著高于PSSP/DOX,由此证明DOX与ELC联用增加DOX的抗肿瘤活性。纳米粒主要通过网格蛋白介导的途径进入细胞,在细胞中利用溶酶体的酸环境和胞质的高还原环境释药。ELC可在低浓度条件下抑制P-gp对DOX的外排,增加胞内含量,另一方面可能间接性引起胞内ATP水平的升高,从而增加能量依赖性的载体摄取,进一步提高DOX的入胞量。体内抑瘤实验表明PSSP/DOX/ELC纳米粒通过不同的给药策略均能明显抑制肿瘤生长,同时HE染色结果显示PSSP/DOX/ELC可显著降低DOX的毒副作用,此外PSSP/DOX/ELC还可有效遏制肿瘤耐药转变前期的药物外排应激反应,降低肿瘤治疗的难度。结论:本文基于PAMAM成功制备了具有还原、pH双敏感性的DOX和ELC联载纳米粒。所制备的纳米粒粒径均一,具有较高的包封率、载药量,体外释放呈现良好的还原、pH双重敏感性。体内外抗肿瘤活性实验结果显示,联载纳米粒可有效逆转乳腺癌多药耐药,增强DOX对肿瘤细胞的毒性,同时有效遏制一般肿瘤化疗初期由耐药转变引起的药物外排应激反应,降低肿瘤治疗的难度,减少毒副作用的发生。该抗肿瘤药物递送系统用于肿瘤治疗具有广阔的应用前景。