【摘 要】
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研究背景:肺癌的早期诊断对于延长患者生命和提高生存质量至关重要。肺癌血清标志物及当前基因突变检测技术的灵敏度及特异度对于早期诊断仍存在一些局限性,因此开发针对于肺癌诊断的灵敏度高,特异性强的基因突变检测方法仍然十分必要。目的:建立一种用于检测肺癌患者血液ctDNA中EGFR 19外显子缺失突变位点的富集技术,该技术基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对野生片段的靶向切割及PCR的扩增富集,使突变
【基金项目】
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湖南省重点研发计划（2017SK2172）；
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研究背景:肺癌的早期诊断对于延长患者生命和提高生存质量至关重要。肺癌血清标志物及当前基因突变检测技术的灵敏度及特异度对于早期诊断仍存在一些局限性,因此开发针对于肺癌诊断的灵敏度高,特异性强的基因突变检测方法仍然十分必要。目的:建立一种用于检测肺癌患者血液ctDNA中EGFR 19外显子缺失突变位点的富集技术,该技术基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对野生片段的靶向切割及PCR的扩增富集,使突变片段能够被一代测序和二代测序所检测到,从而提高肺癌患者外周血中突变位点的检测灵敏度。方法:利用overlap PCR技术合成sgRNA的DNA转录模板,即设计四条具有重叠序列的引物,通过彼此之间的重叠序列,最终合成完整的sgRNA骨架;进一步验证sgRNA的打靶效率和特异性,将Cas9酶、sgRNA、DNA以及酶切buffer共同孵育,然后通过琼脂糖凝胶分析酶切效果;根据NCBI网站及COSMIC数据库查找EGFR 19号外显子序列和常见的缺失突变位点,利用分子克隆相关技术构建野生及突变序列的质粒作为靶DNA序列;制备不同比例的野生与突变片段的混合模板,分别为 10:1、100:1、1000:1、10000:1、100000:1,优化 Cas9/sgRNA酶切偶联DNA聚合酶扩增体系,将PCR产物进行一代测序和二代测序以检测富集效果;另外,我们收集了两例肺癌患者和两例健康人外周血,使用建立后的方法检测标本是否存在EGFR 19号外显子缺失突变。结果:以四条重叠引物为基础,通过延伸反应成功构建了一种无需添加扩增模板的sgRNA的转录模板,转录的sgRNA和Cas9一起可以高效裂解目标DNA片段;将一定量的Cas9酶、sgRNA、DNA以及酶切buffer共同孵育,电泳结果表明Cas9/sgRNA能够快速地消化野生序列,而对突变序列未产生切割带,说明sgRNA特异性强及结合靶点效率高;我们根据网站查找EGFR 19号外显子序列和常见的缺失突变位点,成功构建了野生序列质粒和9种不同缺失突变序列质粒;我们建立了最佳Cas9酶消化野生片段PCR扩增突变片段的反应体系,并使用该方法检测不同混合比例的野生与突变模板,一代测序结果表明富集后,突变序列（0.01%）仍然能够被检测出,二代测序检测发现富集后的突变拷贝数为富集前的几百倍至上千倍;使用该方法检测两例肺癌患者和两例健康人血清中的cfDNA,同样地一代测序能够检测到EGFR 19号外显子缺失突变位点,二代测序突变拷贝数富集上千倍。结论:本课题建立了 一种快速合成sgRNA转录模板的方法,并验证其sgRNA的高效性,将Cas9/sgRNA系统偶联DNA聚合酶建立一种富集血液中EGFR缺失突变片段,提高诊断灵敏度的检测技术,该方法在肺癌早期诊断及靶向用药指导具有潜在的应用价值。
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