水稻纹枯病是一种由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)侵染植株引起的水稻病害。水稻对纹枯病的抗性属于典型的数量性状,目前尚未发现免疫或高抗的主基因抗病水稻种质。本课题组前期应用基因芯片技术分析了易感病水稻品种TP309在纹枯病菌侵染12 h后的基因表达谱,筛选出一个抗病候选基因OsSAM,并通过CRISPR/Cas9敲除和基因过表达技术构建了两种突变体水稻,分别命名为CrSAM、OeSAM。本研究包括对获得的突变体材料进行连续三代的阳性筛选并进行相关纹枯病抗性研究,主要研究结果如下:(1)对T1、T2、T3代水稻材料进行阳性筛选。根据过表达突变体OeSAM的质粒序列设计特异性引物进行PCR扩增鉴定阳性;根据基因敲除突变体CrSAM的CRISPR靶点设计特异性引物进行PCR扩增并测序,检测目的片段的碱基变化鉴定阳性。在T3代获得7个OeSAM阳性株系,1个CrSAM阳性纯合株系。(2)在T3代水稻的分蘖末期采用牙签法进行纹枯病菌接种。于接种后7 d调查病斑面积,结果显示野生型病斑面积为0.74 cm~2,CrSAM病斑面积为4.01 cm~2,OeSAM病斑面积为0.52 cm~2,结果呈极显著差异(P<0.01)。于水稻抽穗后30 d调查纹枯病病级,结果显示野生型病级为6.75,CrSAM病级为8.23,OeSAM病级为4.95,结果呈极显著差异。以上表明CrSAM更易感病,OeSAM更抗病,初步证明基因OsSAM与水稻纹枯病抗性呈正相关关系。(3)在T3代水稻成株期进行基本农艺性状调查,在成熟期进行产量测定。结果显示CrSAM的株高、叶绿素含量、剑叶高、剑叶长极显著低于野生型,分蘖数、分蘖夹角极显著高于野生型;OeSAM的株高、分蘖数极显著高于野生型,剑叶高显著高于野生型(P<0.05)。将水稻农艺性状与对应纹枯病病级作相关性分析,发现CrSAM病级与株高的相关系数r为-0.442,表明在CrSAM中株高与纹枯病病级呈负相关关系。测产结果得野生型产量最高,亩产量为523.23 kg,其次为OeSAM 498.65 kg,CrSAM 264.78 kg。CrSAM亩产量仅为野生型的0.51倍,表明CrSAM病害严重导致减产。(4)用RT-PCR和qPCR技术检测基因OsSAM在野生型、CrSAM与OeSAM的倒三叶叶鞘、倒二叶叶鞘、倒三叶、倒二叶四种水稻组织内的表达量。结果显示在CrSAM水稻组织内未检测到该基因表达;在OeSAM四个部位的该基因表达量均显著高于野生型;在水稻叶片内的表达量均显著高于叶鞘。另外在CrSAM、OeSAM和野生型接种纹枯病菌后的0 h、1 h、24 h、72 h分别取样接种分蘖的倒三叶叶鞘、倒三叶、倒二叶叶鞘、倒二叶进行qPCR检测水稻纹枯病病程相关基因OsPR1b、PDR、E2F的表达量变化。结果表明在水稻倒三叶叶鞘和倒二叶叶鞘中,CrSAM中病程基因表达量最高,其次为野生型、OeSAM,病程基因的表达量与水稻纹枯病病级呈正相关关系。