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J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)诱导鸡免疫耐受是肿瘤发生的先决条件。然而,病毒诱导免疫耐受的原因和致病机制尚不完全明确。先前研究显示,ALV-J可以导致免疫器官中淋巴细胞的严重耗竭,提示T、B淋巴细胞受到了严重的损伤与抑制,也提示免疫抑制性作用在机体中占主导作用。而且有大量研究表明,CD4~+CD25~+调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)在维持机体的免疫耐受中发挥着重要的调控作用,参与多种慢性感染性疾病的发展过程。那么,Tregs是否参与了ALV-J诱导的免疫耐受,且通过何种方式发挥作用?因此,为解析Tregs在ALV-J诱导免疫耐受中的作用,本研究通过建立ALV-J免疫耐受模型,从多个角度评估了免疫应答能力的损伤,利用分子生物学技术,系统研究和阐述了ALV-J先天感染下CD4~+CD25~+Tregs在鸡免疫器官及血液中的动态变化及其与细胞因子、病毒载量变化之间的关系,以期揭示CD4~+CD25~+Tregs在ALV-J诱导的免疫耐受中可能发挥的作用及其病理机制。为模拟ALV-J诱导的机体持续性免疫耐受过程,通过在6胚龄尿囊腔注射ALV-J,建立了先天感染动物模型,通过ELISA与qPCR方法检测到感染鸡体内持续带毒且不产生特异性抗体,确定成功建立免疫耐受模型,以便后续试验展开。通过大体剖检观察与免疫指数检测以及病理组织学观察,对鸡免疫器官的损伤进行评估。大体剖检结果显示,ALV-J感染组鸡的胸腺、法氏囊和脾脏等免疫器官发育不良,表现为体积较小且免疫指数显著降低等特征。病理学组织检查结果进一步显示感染组鸡胸腺、法氏囊中的间质结缔组织较多,而淋巴小结或淋巴滤泡发育不良,淋巴细胞数量较正常组少,提示ALV-J感染后淋巴细胞损伤严重。为进一步探究ALV-J对淋巴细胞的损伤,通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)、免疫荧光(Immunofluorescence,IF)和免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)等方法检测了法氏囊B细胞数量及脾脏中B细胞的数量分布、发育分化能力,结果显示感染组鸡法氏囊与脾脏B细胞数量显著减少,脾脏中IgM~+和IgG~+浆细胞数量显著减少。上述结果提示,ALV-J抑制了B细胞的增殖以及发育分化。为探究T细胞在ALV-J感染后的免疫功能变化,通过FCM和qPCR方法连续分析和监测了鸡血液及免疫器官中CD4~+、CD8~+T细胞亚群比例和细胞因子表达量的变化,FCM结果显示,ALV-J感染后免疫器官和血液的CD4~+T细胞亚群比例显著下降,尤其在7日龄下降最为显著;而CD8~+T细胞亚群比例在早期的血液和脾脏、盲肠扁桃体显著下降,但是在胸腺、法式囊显著上升,后期时各器官均与对照组无差异。qPCR结果显示,ALV-J感染后IL-2、IL-4的表达量持续降低,IFN-γ表达量早期有升高也有降低趋势,在45日龄几乎与对照组无差异,IL-10表达量的持续升高。上述结果提示ALV-J抑制了T细胞的增殖与功能,对CD4~+T细胞的抑制较严重,且机体免疫抑制功能占主导。上述实验结果提示ALV-J感染后免疫负调控的细胞亚群被激活,为解析CD4~+CD25~+Tregs在ALV-J诱导免疫耐受中的作用,运用FCM连续监测了7~60日龄鸡免疫器官及血液中CD4~+CD25~+Tregs频率的变化规律,结果显示,ALV-J感染后血液与免疫器官中Tregs频率显著升高,尤其是在幼龄时期(7~15日龄),随着日龄的增长,Tregs频率仍然维持着在某些免疫器官中的波动性增长。进一步通过FCM分选出CD4~+CD25~+Tregs亚群,qPCR检测细胞中IL-10、TGF-β、CTLA-4的转录水平,结果显示,胸腺、法氏囊、脾脏的IL-10、TGF-β、CTLA-4均显著上升,且与CD4~+CD25~+Tregs数量升高趋势几乎相同,而盲肠扁桃体的Tregs数量升高趋势仅与IL-10的转录水平升高趋势一致,TGF-β、CTLA-4的转录水平仅在个别日龄升高。以上结果提示,ALV-J感染导致免疫器官和血液的CD4~+CD25~+Tregs持续增殖,并通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子以及表达CTLA-4等表面抑制性因子发挥免疫抑制功能;且不同免疫器官的Tregs活化的能力强弱不同。为进一步探究不同免疫器官中Tregs免疫功能的差异是否与病毒相关,通过qPCR对免疫器官中ALV-J病毒载量进行动态监测。结果显示,ALV-J的病毒载量变化趋势与Tregs频率与功能变化趋势呈正相关,而且Tregs免疫抑制功能较低的盲肠扁桃体的病毒载量较其他免疫器官最低。以上现象提示,ALV-J可以诱导机体的Tregs大量增殖,但是Tregs功能的激活需要达到一定的病毒载量。也提示ALV-J可以在Tregs中复制,为验证该推论,通过FCM检测了CD4~+CD25~+Tregs中ALV-J的表达情况,结果显示,约50%的Tregs表面表达ALV-J的SU蛋白。也证明了ALV-J可以在Tregs中复制,即ALV-J可直接作用于Tregs。综上所述,CD4~+CD25~+Tregs在体内的持续增殖活化是ALV-J诱导持续性免疫耐受的重要原因,胸腺、脾脏、法氏囊等免疫器官的Tregs发挥重要免疫抑制功能。ALV-J可直接作用于Tregs,诱导机体的Tregs大量增殖,但是Tregs功能的激活需要达到一定的病毒载量。不过,ALV-J与Tregs互相作用的分子机制仍需更深入的研究。