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背景及目的:缺血性脑卒中(Cerebral ischemic stroke,CIS)属于中医中风范畴,具有发病率、致死率、致残率、复发率均高的四大特点,是严重威胁人类生命和健康的疾病之一。现有研究表明,洋川芎内酯类化合物是中药川芎中主要活性成分及代谢成分,具有抗氧化损伤、抗炎、抗凝及抗血小板聚集、舒张血管、细胞毒等药理作用。洋川芎内酯H(Senkyunolide-H,SEH)为洋川芎内酯类,具有很好的脂溶性和水溶性,能够迅速进入血液和脑脊液,但对其抗脑缺血的药理作用报道较少,尚未见其在保护脑缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤组织方面具有活性的报道。因此,本研究旨在通过网络药理学和体内外实验的方法预测和明确SEH抗脑I/R损伤的作用及其作用机制,为中药治疗CIS的开发提供创新思路。方法:1.网络药理学预测SEH干预治疗CIS的作用靶点和机制。通过PharmMapper服务器预测SEH作用靶点,OMIM数据库、DisGeNET数据库获取CIS相关靶点;利用Cytoscape 3.5.1软件分别构建SEH和CIS相关靶点蛋白相互作用网络,并进行网络合并及拓扑参数分析筛选出SEH治疗CIS的关键靶标;通过DAVID和KEGG数据库对关键靶标进行基因本体(Gene ontology,GO)功能富集分析和通路分析。2.体内实验验证SEH干预保护脑I/R损伤的作用及其机制。将140只雄性ICR小鼠(8周龄)随机分为5组(每组n=28),即假手术组、SEH+假手术组(40mg/kg)、模型组、低剂量SEH组(20mg/kg)、高剂量SEH组(40mg/kg)。制作小鼠大脑中动脉闭塞再灌注(MCAO/R)模型,并于术后0、6、24小时(每组n=14;7只动物用于组织学分析,7只动物用于生化分析)颈椎脱臼法处死小鼠,取脑备用;利用神经行为学评分及TTC染色比较各组小鼠神经功能和梗死体积的差异;利用免疫组化实验检测小鼠缺血侧海马CA1区NeuN标记的神经元核抗原的变化;利用蛋白印迹法测定小鼠缺血半暗带区 PI3K、p-PI3K p85(Tyr458)、Akt、p1Akt(Ser473)、NF-κB、Bcl-XL、Cleaved-Caspase3的蛋白表达。3.体外实验验证SEH干预保护脑I/R损伤的作用及其机制。构建PC12细胞氧糖剥夺再灌注(OGD/R)模型,加入不同浓度的SEH(25,50,100μM),同时设立正常对照组、不给药模型组、抑制剂给药组(LY29400210μM);利用CCK-8法检测细胞活性;采用蛋白印迹法观察各组目的蛋白的表达量。结果:1.网络药理学研究获得SEH治疗CIS的62个关键靶标;GO分析显示此62个关键靶标主要富集在核染色质、转录因子复合物、受体复合物、细胞贴壁连接、核体和基底外侧质膜等细胞成分中,具有结合转录因子、受损DNA、蛋白磷酸酶、转录调控区DNA、肾上腺素受体、ATP、胰岛素受体、以及调节一氧化氮合酶、激酶、蛋白酪氨酸激酶和细胞增殖等分子功能,主要参与调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、DNA模板转录、NF-κB转录因子、蛋白质自磷酸化、表皮生长因子受体和磷酯酰肌醇介导的信号传导途径等生物过程;KEGG分析显示SEH治疗CIS可能通过PI3K/Akt、ErbB、FOXO和神经营养素等信号通路,其中,PI3K/Akt信号通路的调控可能是关键机制之一(均p<0.05)。2.体内实验显示,与MCAO模型组相比,SEH给药组神经功能评分明显降低,梗死体积明显减少;随着缺血再灌注时间的延长,缺血侧海马CA1区NeuN的数量逐渐减少,但SEH给药组NeuN的免疫表达都明显比MCAO模型组高;随着缺血再灌注时间的延长,缺血半暗带区Bcl-XL蛋白水平和p-PI3K p85/PI3K及p-Akt(Ser 473)/Akt蛋白水平比值都逐渐降低,而SEH给药组蛋白水平及比值都较模型组升高;另外,模型组Cleaved-Caspase3和NF-κB蛋白表达随着再灌注时间延长而增加,但SEH给药组Cleaved-Caspase3和NF-κB蛋白表达随着再灌注时间延长而减少(均p<0.05);相比之下,SEH给药假手术组与正常假手术组均无明显差异(均p>0.05)。3.体外CCK-8实验显示与正常对照组相比,OGD组的细胞活力明显降低,但在50及100μM SEH处理的OGD/R组中,其细胞活性随着SEH浓度的增加而逐渐增加,且在100μM SEH干预时升高最明显,而与单独的SEH治疗组相比,10μMLY294002干预后细胞活力显着降低;免疫印迹结果显示OGD/R构建后,细胞Bcl-XL蛋白表达和p-PI3K p85/PI3K及p-Akt(Ser 473)/Akt蛋白水平比值都明显降低,Cleaved-Caspase3和NF-κB蛋白水平升高,而100μM SEH干预组显著提高了 Bcl-XL蛋白表达和p-PI3K p85/PI3K及p-Akt(Ser 473)/Akt蛋白水平比值,并降低了 Cleaved-Caspase3 和 NF-κB 蛋白水平,但 100μM SEH 的作用都被 10μM LY294002抑制(均p<0.05)。结论:1.SEH通过多靶点、多途径发挥治疗CIS的作用,其中PI3K/Akt信号通路可能是SEH治疗CIS的关键机制之一。2.SEH可改善MCAO/R小鼠神经功能,降低MCAO/R诱导的小鼠脑梗死体积,减少脑组织中细胞凋亡。3.SEH可提高OGD/R PC12细胞的活性,抑制OGD/R诱导的PC12细胞凋亡。4.SEH通过调控PI3K/Akt/NF-κB通路减少细胞凋亡发挥保护脑缺血再灌注损伤的作用。