细胞凋亡是由细胞外部或者细胞内部刺激所活化的,受到一系列信号通路紧密调控的细胞死亡的活性过程。凋亡在生物体内一系列正常的生理学过程中发挥着重要作用：免疫系统和中枢神经系统的自我组织过程；胚胎形成过程中形态的变化；成熟动物中各组织的体内平衡；以及受损伤细胞的清除等。细胞凋亡还与人类很多疾病的发病机制相关,如癌症、免疫紊乱疾病、心血管疾病以及由HIV-1感染引起的艾滋病等等。因此,研究细胞凋亡不仅可以了解机体正常生理过程的调控机制,而且能够确定人类很多疾病的病理生理机制,具有非常重要的意义。 病毒感染与凋亡之间的关系是近些年来对病毒与宿主相互作用研究中一个重要的领域。越来越多的实验证据表明,很多病毒采用一定的策略干扰宿主的凋亡通路--通过介入宿主细胞内信号通路体系促进或者抑制凋亡的发生。牛免疫缺陷病毒(BIV)是牛的一种慢病毒,可以在被感染的动物体内引发慢性病变,并与免疫系统的紊乱和损伤有直接的关系。而BIV与凋亡之间的关系一直是未知的。本论文以BIV为研究材料,通过探究它与凋亡之间的关系,揭示BIV感染产生的细胞病变以及疾病的可能机制。 我们利用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口标记技术,并采用DNA染料DAPI将细胞核染色,在荧光显微镜下观测到感染BIV的FBL细胞中TUNEL阳性细胞百分比明显增加,而且部分细胞核发生片断化,证实BIV感染FBL细胞可以引起细胞凋亡的发生。在感染的不同时期检测BIV感染引起的合胞体的数量以及凋亡细胞的百分比,发现两种细胞应答具有相关性,暗示了细胞凋亡在BIV感染引发的病变中可能具有一定的作用。 病毒与宿主之间的相互作用错综复杂,涉及到很多的病毒蛋白以及细胞内的因子。为了探究BIV引发细胞凋亡的机制,我们将目光首先集中在BIV重要的转录激活因子BTat蛋白上。转染BTat的真核表达质粒或者加入体外纯化的蛋白,通过TUNEL染色检测DNA缺口,DAPI染色检测细胞核断裂,DNA ladder检测染色质DNA片断化,流式细胞仪分析细胞周期等实验,证实BTat可以诱导细胞凋亡的发生。另外,由于JDV的重要调控蛋白JTat与BTat同源性达到百分之八十左右,我们同样探究了JTat蛋白与细胞凋亡的关系,得到了相似的结果。我们进一步利用western blotting检测caspase-9、caspase-3和PARP的剪切,证实了BTat和JTat这两种蛋白所介导的细胞凋亡是与caspase信号通路相关的。 在探究BTat和JTat诱导凋亡的机制过程中,我们通过体内免疫共沉淀实验、体内外GST pulldown实验、体外微管组装实验、以及体内共定位分析实验,发现两种蛋白与微管具有直接的相互作用。之后,我们利用体外微管组装实验、细胞内游离的和聚合的微管蛋白分布检测实验,分别在体外和体内证实BTat和JTat可以促进微管的聚合。并通过检测微管的乙酰化程度、以及微管在4℃的稳定性证实这两种蛋白增强了微管的稳定性。进而得出BTat和JTat作为微管结合蛋白可以影响细胞内微管的动力学。 为了证明BTat和JTat蛋白确实是通过影响微管的动力学引发凋亡,我们在细胞内转染JTat的各种缺失突变体,通过测定凋亡的百分比,发现只有能够与微管相互作用的氨基酸序列才可以引起细胞凋亡,证实了两个事件的相关性。而且,在细胞内过量表达Bim,会增加细胞对两种蛋白引发凋亡的敏感性；而利用RNAi作用抑制细胞内Bim的表达则会降低BTat和JTat引发的凋亡；我们还直接检测到了Bim从微管上的释放,证实Bim介导了BTat和JTat所引发的凋亡。 我们的实验揭示了BTat和JTat作为转录激活因子激活转录以外的功能,它们可以与微管结合、影响微管的动力学,并因此诱导细胞凋亡的发生。这一结果为揭示BIV、JDV致病机理提供了新的理论依据。