支气管哮喘简称哮喘(asthma)是由炎性细胞、气道结构细胞、细胞组分共同参与的慢性炎性疾病。患者在吸入过敏原或冷空气、受凉、感染、接触理化性刺激等情况下常可诱发喘息反复发作，引起不可逆性的气道结构改变，最终导致肺功能受损。肺组织中大量炎性细胞浸润，气道壁杯状细胞化生、粘液分泌过度增加、管腔变形阻塞、气道壁增厚、辅助性T淋巴细胞2型（Th2细胞）过度活化、气道反应性增加和血清免疫球蛋白E(IgE)升高是哮喘的基本病理生理特征。目前研究认为:哮喘大多是由敏感个体对环境中某些抗原的异常免疫应答引起的，强调了免疫紊乱在哮喘的发病中占据核心地位。过去的20多年间，Th1/Th2细胞失衡、Th2细胞应答增强的异常免疫应答，一直被认为是哮喘发病的关键环节。随着研究的不断深入，现认为Th1/Th2细胞失衡解释哮喘发病机制存在着局限性，Th1/Th2细胞失衡可能只是哮喘发病的表面现象，而哮喘发病深层的原因是机体对变应原的免疫耐受被打破，Th2/Treg细胞失衡正是打破机体免疫耐受的重要原因。此外，研究者发现Th17细胞亦能够影响哮喘免疫应答及炎症反应，在中性粒细胞哮喘等一些类型的哮喘发病中起关键作用。对动物哮喘模型的研究发现改变Th17细胞或Treg细胞的表达水平可以影响哮喘的气道炎症反应和气道反应性,印证了这一理论。哮喘发病机制复杂。尽管目前已经发现许多新的细胞、细胞组分从不同的途径参与哮喘发病，为哮喘的诊治带来很多新方法。但仍然存在着对包括吸入糖皮质激素在内的综合治疗手段无效的难治性哮喘。这督促我们进一步的深入研究哮喘的发病机制。　　髓系抑制细胞(myeliod-derived suppressor cells，MDSCs)是一群骨髓来源的异质性细胞，由未成熟的巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞组成这一细胞群体。它们缺乏表达于成熟的巨噬细胞、单个核细胞、树突状细胞表面的特征性标志物。MDSCs在人体细胞表面其共同的标志为CD11b+CD14-CD33+;在小鼠体内以共表达髓系谱系分化抗原Gr-1以及CD11b为特征。MDSCs对机体的适应性免疫、固有免疫以及炎症反应均能发挥重要的调节作用，能够引起肿瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病及慢性炎症性疾病、脓毒症、重症感染等。国外研究表明MDSCs在肺部过敏性炎症中高表达，能够影响肺部炎症。既往我们通过对哮喘患儿外周血中MDSCs的检测发现哮喘患儿外周血中MDSCs水平显著高于正常对照组儿童，也提示MDSCs可能参与哮喘发病。MDSCs免疫调节功能与其能够上调精氨酸合酶(Arginine synthase-1，ARG1)以及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表达水平密切相关。　　iNOS系在生理状态下不表达，当机体受到感染、炎症刺激时能够诱导表达。iNOS表达的调节主要发生在转录水平上。iNOS能够合成大量一氧化氮(nitric oxide，NO)。据报道[14]内源性NO通常存在于动物和人类的呼出气中，是重要的呼吸道调节因子。哮喘患者呼出气中一氧化氮(Exhaled nitric oxide，eNO)浓度较正常人增加，且在哮喘恶化时进一步升高，并且研究者认为测量eNO的改变可以反映治疗前后呼吸道炎症水平。既往曾有利用诱导痰、支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、支气管内膜活检直接测量出呼出气一氧化氮和哮喘气道炎症有密切关系，可能与嗜酸性气道炎症、气道过敏性炎症关系较大。目前已知病理条件下肺组织中过量的NO主要由iNOS合成。　　支气管哮喘发病机制十分复杂。MDSCs是新近发现的一群能够调节机体免疫功能的细胞群体，目前研究多集中在肿瘤、重症感染、脓毒症领域。哮喘与肿瘤一样，发病过程中同样存在严重的免疫紊乱，试想MDSCs可能与哮喘发病存在一定的联系。过高的iNOS表达可通过产生过量的NO是引起炎症反应的重要机制之一。适当的干预iNOS的表达能够减轻炎症反应。iNOS/NO系统在哮喘发病中近年来研究较少。鉴于MDSCs能够上调精氨酸合酶和iNOS水平在肿瘤、脓毒症、自身免疫性疾病等发挥重要作用。我们推测哮喘同样为免疫紊乱性疾病，是否也存在MDSCs上调精氨酸合酶和iNOS这一机制尚不知晓。本研究通过建立小鼠哮喘模型，借鉴国内徐晓琴、赵素莲[16]等通过针对Gr-1的抗原抗体反应采用免疫组织化学法检测Gr-1阳性的MDSCs及采用TR-PCR技术检测肺组织中iNOSmRNA在哮喘小鼠肺组织中的表达水平以及布地奈德混悬液的干预效果，试图初步探讨二者与哮喘发病的关系，拓宽对哮喘发病机制的认识。　　目的：　　检测MDSCs及iNOS在哮喘小鼠肺组织中的表达水平，探讨二者与哮喘发病的关系，拓宽对哮喘发病机制的认识。　　材料和方法：　　1.实验小鼠分组和哮喘模型制作　　实验小鼠购自河南省实验动物中心，SPF级、6周龄、健康、雌性BALB/c小鼠30只（实验动物许可证号:SCXK（豫）2010-0002)。实验前1周在郑州大学第三附属医院动物房适应性喂养，期间自由采食及饮水。实验前电子天平测体质量为20-25g。按照随机数字法将实验小鼠分为三组，即对照组，哮喘组及布地奈德干预组（干预组），每组小鼠10只。实验开始第1天、第8天和第15天基础致敏，哮喘组每次每只小鼠给予腹腔注射卵清蛋白(OVA)/氢氧化铝混悬液0.2ml（0.02mgOVA，氢氧化铝粉2mg，加生理盐水至0.2ml），从第22天开始雾化吸入1％OVA激发哮喘发作，每天1次，共重复进行2周，每次激发30分钟;干预组小鼠致敏和激发的方法与哮喘组完全相同，不同的是每次激发前先雾化吸入30分钟1mg(2ml)布地奈德混悬液;对照组小鼠致敏及激发阶段都用生理盐水替代OVA，其方法与剂量均与哮喘组相同。在整个实验过程中，3组小鼠均未有死亡。　　2.小鼠肺组织标本的留取　　留取肺组织标本应于小鼠末次雾化吸入24h内，行乙醚吸入麻醉。固定小鼠于操作台上，开胸，充分暴露小鼠心脏及肺，结扎左侧肺门，摘取左侧肺组织，置于-80℃冰箱中，留做RT-PCR标本。随后插管到肺动脉，用生理盐水反复冲洗，随后注入4％甲醛，摘取右肺中叶置于4％甲醛溶液中固定48小时以上，然后石蜡包埋、连续切成3μm厚度切片，行HE、免疫组化染色。　　3.HE染色　　取固定后肺肺组织，制备蜡块、切片、脱蜡、HE染色。高倍镜下观察气道结构改变及炎性细胞浸润情况，并测定同级别支气管的管壁厚度。　　4.免疫组化染色　　肺组织经固定水、石蜡包埋、冰冻切片，制成3μm厚的切片。采用SP法免疫组织化学染色:脱蜡、脱水、抗原修复、封闭内源性过氧化物酶、加入1∶200的一抗，孵育，4℃过夜;滴加二抗等遵从免疫组织化学染色步骤操作。在显微镜高倍镜(10×40)下观察、摄片。每个标本随机择取5个高倍镜视野范围，应用BI-2000医学病理图像分析系统分析结果，以5个视野下阳性反应的积分光密度值平均值作为该组的测量值。　　5.RT-PCR检测iNOSmRNA表达水平　　-80℃冰箱保存的左肺组织称取约100mg，采用Trizol法提取肺总RNA;加入反转录试剂，反转录成cDNA;添加已设计的iNOSmRNA引物，扩增iNOSmRNA。扩增后产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，用凝胶电泳成像系统分别测定iNOS和内参GAPDHmRNA条带灰度值，并以iNOS与GAPDH的比值作为目的基因mRNA的表达水平。　　6.统计分析　　应用SPSS17.0行统计分析。各组计量资料应用（(x)±s）表示，组间差异性采用单因素方差分析、两两比较用LSD-t检验，α=0.05。相关性分析采用Pearson相关分析，α=0.05。　　结果：　　1.小鼠肺组织病理学改变　　病理学改变:哮喘组表现为气道壁增厚、管腔内含黏液及脱落变形的上皮细胞、管腔狭窄、杯状细胞化生、粘液分泌增多、大量炎性细胞浸润。布地奈德组较哮喘组减轻。对照组气道壁厚度正常，管腔无狭窄，无杯状细胞化生，可见散在少量炎性细胞。见附图3-2A、B、C，附表3-2。　　2.小鼠肺组织免疫组化结果　　高倍镜下可见Gr-1阳性的MDSCs表现为胞质、胞膜棕褐色，主要位于肺泡间质、支气管壁、血管壁周围。哮喘组MDSCs的表达水平(155.35±15.51)显著高于对照组(112.27±4.65);布地奈德干预后MDSCs的表达水平(129.32±8.91)明显低于哮喘组，P＜0.05;干预与对照组相比差异有统计学意义。见附表3-3，附图3-3A、B、C。　　3.小鼠肺组织RT-PCR结果　　RT-PCR结果显示，目的基因iNOSmRNA片段位于100bp-200bp条带之间，哮喘组目的基因亮度最强，其灰度值(0.637±0.051)高于对照中(0.178±0.022);干预组iNOSmRNA(0.347±0.033)低于哮喘组iNOSmRNA(0.637±0.051)，(P＜0.05);干预组与对照组相比较，差异统计学意义。见附图3-4。　　4MDSCs、iNOSmRNA相关性分析:　　哮喘组小鼠肺组织MDSCs与iNOSmRNA呈正相关，相关系数为:r=0.667，P=0.031。　　结论：　　1.MDSCs、iNOS参与哮喘炎症反应。　　2.MDSCs可能促进iNOS基因的表达，在哮喘炎症反应中发挥作用。　　3.布地奈德可能通过抑制MDSCs、iNOS基因的表达，改善哮喘炎症反应。