肿瘤的形成过程目前尚未在学术界获得统一的认识。以往的随机理论认为基因的变异以一种完全随机的方式在细胞内积累,并且细胞随机的发生了恶性的转变。该理论在试图揭示临床种种现象时遇到了困难,比如获得性耐药等。近年来肿瘤干细胞理论得到了越来越多的实验支持。研究发现急性髓细胞样白血病细胞中能分离出与骨髓造血干细胞具有相同干细胞表面标志的癌细胞,这些细胞能在免疫缺陷小鼠中诱导急性髓细胞样白血病的发生;这表明肿瘤组织中可能存在既具有干细胞特征,又具有肿瘤特征的肿瘤干细胞。目前,有文献报道,在多种实体瘤中发现有肿瘤干细胞的存在,例如乳腺癌、脑肿瘤等。原发性肝细胞肝癌是我国常见恶性肿瘤之一,由于预后差,死亡率较高。临床观察发现,肝癌组织内的细胞在耐药性上存在差异,这种异质性的表现间接暗示了肿瘤干细胞的存在。对这群细胞的分离和鉴定对阐明肝癌发病机理、揭示肝癌复发和转移的机制具有重要的意义。边群细胞是最近干细胞研究领域最热门的一个研究方向。由于该类细胞表面表达人类乳癌耐药蛋白(BCRP),且该膜蛋白能够排出Hoechst33342,从而使用流式细胞仪能够对其进行分选。该方法首先在分离骨髓造血干细胞上获得了成功,随后的研究表明,利用该方法可以从多种组织中高效、快速地分离得到成体干细胞。目的:利用Hoechst33342染色、流式细胞仪分离技术分离人类肝癌细胞系来源的边群细胞。在体外培养的情况下,对边群细胞的分化能力和抗凋亡能力进行检测。对人类乳癌耐药蛋白进行克隆,对人类Tg737基因在边群细胞中的缺失突变情况进行检测。方法:1.对人类肝癌细胞系MHCC97、hHCC、Bel-7402中的边群细胞进行分析,对MHCC97中的边群细胞进行分选;1)细胞常规培养;2) 0.25%胰酶温和消化细胞,常规离心并以HBSS液洗涤细胞;3)细胞悬液分为两组,一组单纯用Hoechst33342进行染色,另一组同时加入钙通道拮抗剂和相同浓度的Hoechst染料,两组细胞均染色90分钟,然后以流式细胞仪检测肝癌细胞中的Hoechst荧光,通过使用双色性反射滤镜和不同的组合滤片将每个肝癌细胞中荧光信号分为两个部分—Hoechst蓝光部分和Hoechst红光部分,采集这些光信号,并利用流式细胞软件形成二维散点图,分析两组肝癌细胞在二维散点图上的形态,通过设定“门”找出肝癌细胞中的边群细胞,并边群细胞进行分析和分选。2.边群细胞的分化能力的检测1)根据Genebank中提供的甲胎蛋白(AFP)和细胞角蛋白19(CK19)的基因序列,使用Primer5引物设计软件分别对两条基因进行半定量引物的设计,并送公司合成。分别以边群细胞和非边群细胞两种细胞群的cDNA为模板,行半定量检测。提取两群细胞的总蛋白,对AFP和CK19行蛋白定量检测;2)将两群细胞接种盖玻片,分别行AFP和CK19双色免疫荧光检测,以及Bcrp的免疫荧光检测;3)将两群细胞分别接种裸鼠,待成瘤后对瘤体冰冻切片,对片子行AFP和CK19的双色免疫荧光检测。3.边群细胞的抗凋亡能力的检测1)分选后的两群细胞进行常规培养12小时,待细胞全部贴壁后,以PBS缓冲液替换完全培养基,按培养3、6、9个小时分别分组;2)根据Genebank中提供的p53、Bcl-2和Bax的基因序列,使用Primer5引物设计软件分别对三条基因进行半定量引物的设计,并送公司合成。分别以经上述处理并分组的细胞的cDNA为模板,行半定量检测。提取细胞的总蛋白行蛋白定量检测;3)分选后的细胞接种96孔板,常规培养贴壁后,以PBS缓冲液替换完全培养基,培养3、6、9个小时,使用MTT法检测细胞在营养缺乏的情况下的增殖能力;4)分选后的细胞分别接种盖玻片,常规培养并按上述方法处理,并对细胞行Bcl-2和Bax的双色免疫荧光检测。4.人类乳癌耐药蛋白(Bcrp)的克隆根据Genebank中提供的Bcrp的基因序列,使用Primer5引物设计软件设计Bcrp的巢式引物,以边群细胞的cDNA为模板行聚合酶链反应,将反应产物进行电泳,并回收电泳中的目的条带,克隆入pMD18T载体,送生物公司测序。5.人类Tg737基因在边群细胞中的缺失情况的检测根据Genebank中提供的Tg737的基因序列,使用Primer5引物设计软件设计Tg737的引物,以边群细胞的cDNA为模板行聚合酶链反应,将反应产物进行电泳,并回收电泳中目的条带,克隆入pMD18T载体,送生物公司测序。结果:1.流式细胞仪的双波长荧光分析结果显示在二维散点图上有边群细胞存在。其中,MHCC97细胞系中边群细胞的比例接近0.25%,hHCC细胞系中比例接近0.5%,Bel-7402细胞系中比例接近0.45%。加入钙通道拮抗剂后该群细胞明显减少,因为低荧光的特征消失而进入到了非边群细胞群中,这表明三种肝癌细胞的边群细胞的表型均与Bcrp载体的主动外泵作用有关;2.通过半定量检测、蛋白定量以及免疫荧光检测,发现MHCC97来源的边群细胞中AFP和CK19均有表达,而AFP表达水平明显较非边群细胞中为高。通过体外成瘤实验,发现瘤体中仅有部分细胞同时表达AFP和CK19。而对体外培养的边群及非边群细胞行Bcrp的检测,发现高度表达Bcrp的细胞位于边群细胞形成的克隆的中心周围,呈环形排列,而非边群细胞形成的克隆中也有表达Bcrp的细胞存在;3.通过MTT法,发现在营养缺乏情况下,边群细胞较非边群细胞的生长增殖能力为强。通过半定量分析和蛋白定量分析,发现在边群细胞中,Bcl-2的表达水平上调,Bax的水平出现下调,而非边群细胞中刚好相反。免疫荧光的分析结果同上。4.将测序结果与Genebank中人类乳癌耐药蛋白的序列进行比对,结果显示,pMD18T载体中所含有的基因片断与人类乳癌耐药蛋白的基因序列同源性达到99%。5.将测序结果与Genebank中人类Tg737基因的序列进行比对,结果显示,pMD18T载体中所含有的基因片断与人类Tg737的基因序列相比,出现大片断的缺失和点突变。缺失部分位于第345个至第401个碱基,第1048个至第1148个碱基,第1650个碱基至第1741个碱基以及第2436个碱基至第2546个碱基之间,共缺失359个碱基。点突变位于第793个碱基,由C突变为T,蛋白产物由丝氨酸突变为苯丙氨酸。结论:1.利用Hoechst33342染料通过流式细胞仪技术确认人类肝癌细胞系MHCC97、hHCC和Bel-7402中存在边群细胞。2. MHCC97来源的边群细胞共同表达AFP和CK19,这提示了边群细胞确实具有一定的双向分化能力。这说明边群细胞具有一定的原始特征。3.边群细胞体外培养形成的克隆中,Bcrp强阳性的细胞呈环形围绕克隆中心分布,提示了边群细胞在分裂增殖的过程中,以环形向外生长,外围和中心的细胞都是由边群细胞分裂而来的非边群细胞,分裂后仍保持边群细胞特征的细胞都处于中心和外围细胞之间。非边群细胞体外培养形成的克隆中,也有Bcrp强阳性的细胞存在,但是,这些细胞数量较少,且在克隆中散在分布。这个发现,与临床上肿瘤中心常为坏死组织的现象一致,也提供了先化疗后手术的实验基础。非边群细胞形成的克隆中有边群细胞的存在,说明流式细胞仪分选过程可能不够完善,有少数边群细胞漏网,或者可能是有比边群细胞更原始的细胞存在,而这些细胞的特征尚不为人所知。4.在营养缺乏的条件下,相比较非边群细胞,边群细胞具有更加明显的抗凋亡能力。并且,与非边群细胞相反,边群细胞中的Bcl-2表达上调,而Bax表达下调,促进了边群细胞的存活。这可能是边群细胞较非边群细胞具有明显的抗凋亡能力的机制所在。5.人类乳癌耐药蛋白Bcrp被成功克隆入pMD18T载体,测序同源性99%,可以用于后续的实验。6.人类Tg737基因在边群细胞内出现大片断的缺失和点突变。由于该基因位于13号染色体的着丝粒附近,乙肝病毒x蛋白或其它机制对该区具有破坏作用,可导致该区多种基因缺失变异。因此,该基因缺失的一种可能原因是病毒感染或其它机制所造成的一个副事件。然而,Tg737的蛋白产物构成的复合体在EGFR轴、b连环蛋白、细胞骨架、细胞周期调节、细胞黏附等方面均有重要的作用。对于细胞的恶性转化,这些方面的改变都是必须的。因此,另外一个可能原因是Tg737基因缺失变异属于细胞恶性改变的早期的和必须的事件。