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川金丝猴(Rhinopithecus roxellana)为我国特有物种,国家一级重点保护动物。《中国濒危动物红皮书》和世界自然保护联盟(IUCN)分别将川金丝猴列为濒危物种(E)和易危物种(VU)。湖北神农架是我国川金丝猴地理分布的最东缘,只有1200多只,其中神农架大龙潭有野生金丝猴(人工补食群)约80只;小龙潭有笼养猴(野外救治个体)9只,生存状态极度濒危。疾病问题是危害和威胁金丝猴种质资源保护的重大问题之一。因此对神农架金丝猴常见病进行流行病学初步研究具有重要意义。本研究主要包括对神农架大龙潭和小龙潭金丝猴结核、致泻性病原菌、B病毒和猴巨细胞疱疹病毒等猴常见重大病原微生物进行病原学或血清流行病学调查,并建立了猴结核IFN-?检测方法。1.猴结核IFN-γ体外释放检测法的建立与初步应用传统猴结核检测方法为结核菌素眼睑皮内注射检测法(简称皮试),具有特异性差、对猴体刺激大、操作时间长、不可追溯等缺点。本研究旨在建立猴结核IFN-γ体外释放检测法,用于猴结核病的特异性诊断。运用本实验室保存的原核表达的猕猴IFN-γ重组蛋白免疫Balb/C小鼠,再利用杂交瘤细胞技术获得12株高效价的单克隆抗体;同时免疫日本大耳白兔获得猕猴IFN-γ抗血清,经纯化后得到高效价猕猴IFN-γ多克隆抗体。首先用所获得的鼠抗IFN-γ单克隆抗体及兔抗IFN-γ多克隆抗体建立了检测猕猴IFN-γ的夹心ELISA,检测重组猕猴IFN-γ的灵敏度达到62.50pg/m L。该IFN-γ检测法与进口商品化试剂盒的总体符合率为93.84%,?=0.7800,表明具有较好的一致性。以眼睑皮试法为参考方法,先用皮试法检测146只猕猴,再用进口商品化的IFN-γ检测试剂盒检测猕猴外周血淋巴细胞在牛和禽结核菌素刺激下释放的IFN-γ量,利用ROC曲线确定猕猴结核IFN-γ检测法的临界值为114.5pg/m L,对皮试法的灵敏性为68.18%,特异性为91.94%。应用本研究所建立的猕猴IFN-γ检测法对10份神农架金丝猴血液样本进行检测,凝集素刀豆蛋白Con A刺激的全血样本产生的IFN-γ浓度为1512?166.0 pg/m L,与猕猴样本产生的IFN-γ水平类似(猕猴产生的IFN-γ浓度为1050?278.0 pg/m L),表明本方法可以用于金丝猴结核病的检测。10份金丝猴临床样本经牛结核菌素和禽结核菌素刺激的全血样本与阴性对照全血样本产生的IFN-γ浓度无差别,表明10只金丝猴结核病均为阴性。总之,该研究建立了猴结核IFN-γ体外释放检测法,在猕猴结核检测中进行了初步应用,并可望用于金丝猴结核病检测,从而为猴结核检测提供了新型技术手段。2.神农架金丝猴粪便中致泻性病原的分离鉴定本研究旨在对从神农架采集的38只金丝猴的76份粪便样品(包括8份腹泻样品)进行致泻性病原鉴定,包括致泻性大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌等。结果从2只腹泻猴样本中鉴定出两株致泻性大肠杆菌,沙门氏菌和志贺氏菌未检出。对所分离细菌进行了培养特性和形态特征观察及生化试验,进一步开展了一系列检测,如PCR分群、毒力相关基因检测、O抗原鉴定、LD50试验、药敏试验等。PCR分群结果表明,分离得到的两株菌属于大肠杆菌D群;PCR扩增出eae(482bp)、esc V(544bp)等毒力基因,确定所分离菌株为非典型肠致病性大肠杆菌(a EPEC)。对a EPEC进行分型鉴定,扩增出黏附素β(562bp)基因,表明两株分离株为黏附素β亚型;分离得到的菌株血清型均为O98;两株分离菌株对小鼠致死性较弱,LD50分别为1.130×108 CFU和5.260×107CFU。药敏试验结果表明,两株菌都对氨基糖苷类、氟喹诺酮类和磺胺类等抗生素敏感。在第三代头孢中,大肠杆菌应该对头孢噻肟和头孢他啶耐药敏感,但检测发现分离株对这两种药耐药。此外,其中菌株1对亚胺培南和美洛培南耐药,而菌株2对其敏感。以上结果表明,此次神农架金丝猴腹泻可能是由非典型肠致病性大肠杆菌引起的,其中一株菌已具有一定的耐药性。研究结果为金丝猴腹泻性疾病的防治提供了科学依据。3.神农架金丝猴常见病毒病血清流行病学初步调查本研究旨在对神农架小龙潭7只笼养猴和大龙潭3只野生猴血清进行猴常见9种病毒抗体检测,包括B病毒(BV)、猴T细胞趋向性病毒(STLV-1)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV)、猴泡沫病毒(SFV)、猴巨细胞病毒(Rh CMV)、猴水痘病毒(SVV)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)和甲肝病毒(HAV)。结果,10只金丝猴中有6只猴B病毒Ig G抗体阳性,感染率为60%(6/10);2只猴巨细胞病毒(Rh CMV)抗体阳性,感染率为20%(2/10);猴T细胞趋向性病毒(STLV-1)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV)、猴泡沫病毒(SFV)、猴水痘病毒(SVV)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)和甲肝病毒(HAV)等未检出。由于金丝猴物种的濒危地位,只采集10只猴的血液样本,但此研究结果却对金丝猴疾病的监测和防控具有重要意义。