在临床工作中,糖皮质激素已经得到广泛、有效的使用,但是长期或大量的全身或局部使用糖皮质激素会引起激素性白内障。激素性白内障多为双眼发病,临床表现以后囊下混浊为主,有时可与年龄相关性白内障等其它类型的白内障并发。激素性白内障的发病机制尚不明确,目前有蛋白质加和物学说、氧化损伤学说、渗透压失衡学说等多种假说。但是,早期激素性白内障都伴有晶状体蛋白质的异常连接、变性、透明度降低等变化。目前,尚无资料确定是何种晶状体蛋白质最先受到糖皮质激素的攻击,分离和鉴定糖皮质激素早期攻击的晶状体蛋白质,可利于今后研究这些蛋白质的特性和功能,从白内障最薄弱的环节入手,有可能抓住白内障发生的中心环节,为研究激素性白内障的发病机制及寻找有效治疗激素性白内障的药物打下基础。目的:分离与鉴定早期被地塞米松攻击的晶状体蛋白质,为进一步揭示激素性白内障发生发展过程中激素对晶状体蛋白质的修饰作用,研究易被激素攻击的蛋白质的特性与功能打下基础。方法:建立离体大鼠激素性白内障模型:2月龄雌性新鲜的大鼠晶状体共42只,分为3组,对照组与不含地塞米松的培养液孵育,其余孵育条件与实验组相同,实验组与含荧光标定的地塞米松培养液(浓度5μM、10μM)孵育;每天观察晶状体形态及混浊程度,并随机从各组取2只晶状体制作冰冻切片,荧光显微镜下观察晶状体切片荧光强度,找出大鼠晶状体孵育的最佳浓度和时间。2月龄雌性大鼠新鲜晶状体各50只分别与荧光标定的地塞米松(10μM)孵育3 d和5 d,对照组50只与不含地塞米松的培养液在相同的条件下孵育相同的时间,去除囊膜后匀浆,凝胶过滤层析(Sephacry S-300HR)分离水溶性蛋白质(流速50 ml/h,每一组份收集5ml),采用紫外分光光度计和荧光光度计分别测量所收集的每一晶状体蛋白质组份280nm的光吸收值和荧光强度(INT)值,绘制洗脱图及INT值曲线。荧光含量较多的蛋白质组份为地塞米松攻击的主要蛋白质组份,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和鉴定荧光含量多的该蛋白质组份,并对该组份中高含量的晶状体蛋白质进一步进行MALDI-TOF肽质谱指纹图分析,以期确定早期被地塞米松攻击的晶状体蛋白质,并试图找到地塞米松与晶状体蛋白质的结合位点。结果:1.对照组晶状体未出现明显混浊,而5μM组晶状体和10μM组晶状体分别在第3 d和第2 d时开始出现混浊; 5μM组晶状体孵育不同时间后在荧光显微镜下未见荧光显色,10μM组晶状体在孵育3 d时开始表现出不同的荧光强度,至7 d时晶状体冰冻切片表现强荧光。2.实验组晶状体蛋白质色谱图显示α-晶状体蛋白峰的出现较对照组有不同时间的提前;孵育3 d和5 d后,10μM组晶状体蛋白质色谱图及INT值曲线显示α-晶状体蛋白对应的INT值较高,而β和γ-晶状体蛋白对应的INT值很低。3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示地塞米松含量高的晶状体蛋白质组份的分子量约在20 KD左右,与对照组相比较,实验组的蛋白质条带增多,提示可能有较多的蛋白质聚合物或交联物形成。MALDI-TOF肽质谱指纹图分析该系列蛋白质为αA-晶状体蛋白,提示地塞米松攻击的主要蛋白质是αA-晶状体蛋白。未能通过MALDI-TOF肽质谱指纹图分析找出α-晶状体蛋白与地塞米松结合的位点。结论:1.荧光素可作为地塞米松的示踪剂应用在早期被地塞米松攻击的大鼠晶状体蛋白质的分离与鉴定实验中。2.早期地塞米松攻击的晶状体蛋白质主要是αA-晶状体蛋白。α-晶状体蛋白被地塞米松修饰而导致其功能的降低,可能在激素性白内障的发病机制中起重要作用。创新点:1.在国际上首次应用荧光素作为示踪剂分离和鉴定早期被地塞米松攻击的晶状体蛋白质,利用荧光素标定的地塞米松与离体大鼠晶状体进行孵育,并利用荧光显微镜对晶状体冷冻切片进行观察,确定地塞米松在晶状体内的分布情况,并找到了用荧光素标定的地塞米松孵育离体大鼠晶状体的合适浓度和时间。2.通过蛋白质层析、荧光光度计、SDS-PAGE、质谱分析等实验手段,测定早期地塞米松攻击的大鼠晶状体蛋白质,检测晶状体蛋白质与地塞米松分子结合的位点。