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凤梨草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是蔷薇科多年生草本植物,果实颜色鲜艳,果肉鲜美,营养丰富,深受消费者的喜爱。草莓果实中含有大量黄酮类物质,其中花青素是一种重要的水溶性色素,赋予草莓果实和叶柄鲜艳的颜色。花青素在内质网中合成,在液泡中积累。花青素合成途径已经较为清楚,而其转运机制却研究较少。本课题组通过ENU诱变白果森林草莓YW5AF7,获得一个叶柄花青素显著下降的突变体。本研究主要以此突变体和三种森林草莓野生型YW5AF7,Ruegen,H4为材料,通过遗传学分析、全基因组重测序、进化树分析、瞬时转化、稳定转化、表达模式分析等方法对致突变基因进行克隆和功能解析,首次报道了草莓中介导花青素转运的关键基因,具有重要的理论意义和应用价值。主要结果如下:1.通过ENU诱变获得一棵突变体,其叶柄和叶片花青素含量显著下降,命名为Reduced Anthocyanins in Petioles(rap)。野生型YW5AF7叶柄表面和维管束周围呈红色,而rap叶柄中相同部位没有红色色素的积累。与野生型相比,突变体叶柄中的总花青素含量显著下降,与表型观察一致。创建rap与YW5AF7回交F2代群体,其野生型与突变体植株的比率接近3:1,说明rap是由单基因隐性突变所致。通过混池基因组重测序数据分析发现gene31672第二个外显子上存在一个C到T的SNP,能够引起翻译提前终止,表明该基因是RAP候选基因。对F2群体中50个突变单株测序发现该SNP均纯合,进一步证明gene31672与表型连锁。此外,我们发现rap叶柄中RAP表达量显著下降,说明RAP转录本由于无意介导的衰变而降解。2.在森林草莓中,RAP有7个同源基因,同属于GST家族中的phi亚家族。这8个GST基因具有不同的表达模式。RAP在Ruegen果实中表达量最高,且随着果实成熟显著上调。对RAPpro::GUS转基因株系GUS活性分析表明RAP在叶柄表皮和维管束组织特异表达。在拟南芥突变体tt19-7中过表达RAP时,下胚轴、茎秆和叶片重新积累花青素,表明RAP是拟南芥中TT19的直系同源基因。3.将Ruegen与rap杂交,在66棵绿色叶柄的F2代植株中分离出一棵带有MYB10的纯和突变体材料(MYB10+;rap-),说明MYB10与RAP连锁。与野生型Ruegen相比,该交换单株果皮几乎不积累花青素,瘦果颜色也显著变浅,表明RAP是调控果实颜色的关键基因且位于MYB10下游。q RT-PCR检测表明RAP与MYB10有共表达趋势。HPLC分析表明MYB10+;rap-中各花青素成分显著低于MYB10+;RAP+,说明RAP转运花青素具有广谱性。4.瞬时转化实验表明,同时过表达RAP和MYB10能使rap果实重新积累花青素,而其它同源基因过表达却不能达到相同效果。烟草瞬时转化实验表明RAP、RAP-L1和RAP-L3-5定位于细胞质和细胞核,部分定位于液泡膜,而RAP-L2定位在叶绿体上。这些结果说明,除了表达水平调控,蛋白序列和亚细胞定位变化也是RAP同源基因功能分化的因素。此外,蛋白结构域置换实验表明RAP的N端与C端共同决定了花青素转运活性。5.在rap背景下稳定过表达RAP时,叶柄重新变红;根尖和雌蕊柱头等本来不积累花青素的部位也变红;果实变红,但不同于野生型且不依赖MYB10。用RNA干扰瞬时下调栽培草莓果实中RAP的表达水平,花青素含量显著下降。这些结果说明,RAP可作为草莓果实颜色育种的候选基因。