乳腺癌是全球女性癌变诊断率最高的癌症之一，由于其高转移活性以及转移后高达90％的死亡率而备受人们关注。无序生长和高运动活性是转移性乳腺癌细胞的重要特征，这两个过程都涉及到细胞肌动蛋白骨架在各种肌动蛋白结合蛋白调节下的解聚与重排。钙调蛋白结合蛋白(Caldesmon，CaD)是存在于几乎所有脊椎动物细胞中的肌动蛋白结合蛋白，有由同一基因衍生的两种亚型：平滑肌型(h-caldesmon，h-CaD)和普遍存在的非肌型轻链CaD(1-caldesmon，1-CaD)。　　 体外研究表明，1-CaD通过与肌动蛋白结合，稳定肌动蛋白纤维结构，抑制其解聚。因此，人们都普遍认为1-CaD在细胞内的基本功能为减弱细胞骨架调整，抑制细胞运动活性。事实上，在众多非转移性癌细胞中，1-CaD的表达量显著下调，但在一些高迁移活性的转移性癌细胞中，1-CaD不仅表达量明显增加，胞内磷酸化程度也大幅度提高，抑制细胞运动活性显然不能完全概括1-CaD在转移性癌细胞中的功能。为揭示1-CaD对转移性乳腺癌细胞迁移运动活性的影响及其调节机制，并为进一步认识乳腺癌本质提供了新的思路，本研究以人源转移性乳腺癌细胞MD MB-231和非转移性乳腺癌细胞MCF-7作为实验载体，首先，通过构建体外肌动蛋白聚合阵列验证了1-CaD及其磷酸化对肌动蛋白聚合过程的影响；其次，通过基因沉默和外源基因高表达相结合的方法，探索1-CaD及其磷酸化对转移性乳腺癌细胞迁移运动活性的可能调节机制；最后，我们将模拟1-CaD磷酸化位点封闭的合成多肽导入MD MB-231细胞内并通过裸鼠肿瘤形成模型，进一步检测1-CaD及其磷酸化对转移性乳腺癌细胞迁移运动活性以及在体肿瘤形成能力的影响。我们的主要研究内容包括：　　 ①体外蛋白层次上，利用荧光标记的G-actin，在F-actin缓冲体系中，不同时间位点分别加入1-CaD的C-端功能片段H32K及其磷酸化形式，检测G-actin聚合形成F-actin的动力学过程。结果显示，H32K能够迅速与肌动蛋白结合，并对肌动蛋白的聚合过程有双重调节作用：在肌动蛋白聚合初期，H32K将抑制成熟肌动蛋白纤维的形成；在肌动蛋白聚合过程中，H32K将促进成熟肌动蛋白纤维的形成。磷酸化H32K失去了对肌动蛋白聚合初期的抑制作用，对肌动蛋白聚合无显著影响。　　 ②细胞层次上，western-blotting检测MDA MB-231、MCF-7以及正常人源上皮细胞HMEC的胞内1-CaD表达量及其磷酸化程度。结果显示，1-CaD在MDAMB-231细胞中获得了显著高表达，其表达水平与HMEC细胞相当，而MCF-7的1-CaD表达量显著低于MDA MB-231细胞。除此之外，MDA MB-231胞内1-CaD磷酸化水平显著高于HMEC细胞。1-CaD在转移性乳腺癌细胞中的高表达以及显著高于正常细胞的磷酸化水平，可能是转移性乳腺癌细胞高侵袭表象的一个重要因素。　　 ③利用siRNA慢病毒载体感染MDA MB-231细胞，抑制胞内1-CaD表达，首先，通过western-blotting，检测1-CaD基因沉默的效率；其次，通过rhodaminephalloidin染色细胞骨架，考察1-CaD表达沉默对细胞骨架结构的影响，再次，通过Transwell检测细胞的迁移运动能力，最后通过Traction force、细胞粘附阵列进一步检测细胞迁移过程中的细胞基底牵张力与基底粘附能力。结果显示，1-CaD表达沉默将导致细胞失去完整的细胞骨架结构，胞内应力纤维结构消失，细胞的迁移运动活性显著下降，细胞迁移过程中的细胞基底牵张力与粘附能力亦显著下调。　　 ④利用外源野生型wtCaD以及模拟PAK和ERK磷酸化位点封闭的1-CaD突变株A1234和模拟PAK和ERK位点完全磷酸化的突变株D1234作为“分子探针”来干扰或阻断胞内1-CaD磷酸化进程。检测外源1-CaD质粒的表达效率，考察高表达外源1-CaD细胞的骨架结构，检测细胞的迁移运动活性以及细胞基底牵张力与粘附能力。结果显示，wtCaD与A1234转染的细胞，细胞骨架显著增强，细胞基底牵张力与粘附能力明显上调，但细胞整体迁移运动能力明显受到抑制；D1234对细胞骨架结构无显著影响，但明显抑制了转移性乳腺癌细胞的迁移运动能力，对非转移性乳腺癌细胞的影响不显著。　　 ⑤合成模拟1-CaD在PAK与ERK磷酸化位点封闭的多肽，并导入MDA MB-231细胞内，检测细胞骨架结构变化，考察细胞的增殖和迁移运动活性，通过裸鼠肿瘤形成模型，检测多肽导入后的MDA MB-231在体肿瘤形成能力。结果显示，合成多肽能够显著抑制MDA MB-231细胞的增殖和运动活性以及在体的肿瘤形成能力。　　 综合以上结论我们推测，1-CaD是转移性乳腺癌细胞骨架结构的重要组成部分和调节因子，并能通过介导细胞骨架结构调整影响乳腺癌细胞迁移运动活性。1-CaD在转移性乳腺癌细胞内的高表达和高效的磷酸化-去磷酸化循环可能是维持转移性乳腺癌细胞高迁移活性的关键因素，抑制1-CaD在胞内的表达或干扰其胞内磷酸化循环都将显著抑制转移性乳腺癌细胞的迁移运动活性。模拟非磷酸化1-CaD的合成多肽对转移性乳腺癌细胞在体肿瘤形成能力的抑制作用为1-CaD的磷酸化突变株在乳腺癌临床治疗中的可能性应用打下了新的实验性基础。