培养的哮喘豚鼠气道平滑肌细胞ryanodine受体内钙释放功能的改变及其mRNA表达的变化前言哮喘是一种世界范围内严重危害人类健康的慢性炎症性疾病。其发病机理相当复杂，诸多因素参与其中。近年来，人们逐渐认识到气道平滑肌细胞（airwaysmooth muscle cells ASMCs）在介导哮喘的发病机制中起到了重要作用，而钙离子作为细胞内重要的第二信使参与调节了ASMCs的许多重要功能。细胞内钙离子浓度([Ca²⁺]i)升高在介导哮喘的气道高反应性，气道重构以及气道炎症中起到了非常关键的作用。细胞内钙离子浓度升高主要通过外钙内流和内钙释放两种途径实现。目前，对外钙内流与哮喘关系的研究较为深入，临床上已有应用钙拮抗剂，通过抑制ASMCs的外钙内流治疗哮喘。而对内钙释放的研究相对较少。ASMCs中存在三磷酸肌醇受体（IP3R）和ayanodine受体／钙通道（RyRs）两种内钙释放通道。有研究发现，IP3R和ayRs参与乙酰胆碱诱导引起的平滑肌细胞内重复持续的钙浓度改变。这种改变不能由IP3单独启动且不能被IP3R抑制剂完全抑制，但可被RyRs抑制剂完全抑制。本研究正是基于此点，制备卵蛋白诱导的哮喘豚鼠模型，分离培养其ASMCs，通过测定ASMCs内钙离子浓度的改变，并从分子水平研究ASMCs中RyRs各亚型mRNA的表达情况，比较正常和支气管哮喘时的差异，以此提供哮喘发病的理论依据，也为开发治疗哮喘的药物提供新的作用靶点。同时，尝试传代培养哮喘豚鼠ASMCs，比较传代与原代培养的ASMCs中RyRs内钙释放通道的改变，探索获得具有“哮喘”特性ASMCs的方法。实验材料和方法1、材料胶原酶（日本制药株式会社），鸡卵清白蛋白（美国Sigma公司），ryanodine（美国Sigma公司），组织胺（histamine）（上海生化研究所），DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（天津市生化制品厂），Flou-3／AM，EGTA和HEPES（美国Sigma公司），平滑肌特异α-肌动蛋白抗体（武汉博士德生物工程公司），FITC（中国医科大学免疫教研室赠）。RT-PCR试剂盒（TaKaRa公司）。Trizol reagent（美国Gibco公司）。健康雄性豚鼠，体重0.3～0.4Kg。中国医科大学实验动物部提供。2、方法豚鼠哮喘模型的制备：健康雄性豚鼠，体重0.3～0.4Kg。中国医科大学实验动物部提供。将豚鼠随机分成空白对照组和哮喘组。哮喘组豚鼠腹腔注射10％卵蛋白生理盐水溶液1mL，于第14天开始隔天超声雾化吸入1％卵蛋白，每次2min，激发7次，观察动物状态。动物逐渐出现呼吸加快，最后出现腹式呼吸，提示造模成功。对照组采用生理盐水雾化吸入，液体容积与哮喘组相同。豚鼠ASMCs的分离培养：单只豚鼠击头处死，无菌取其全部主气管。冰浴条件下，分离其外周结缔组织及脂肪组织，剪开其软骨面，用棉签轻轻刮除气管粘膜及粘膜下层后，分离两侧的软骨，将分离的平滑肌束切成1 mm×1 mm×1 mm小块，以0.2％胶原酶37℃、通气（95％O2和5％CO2）的条件下，消化2次，每次40 min，而后冲洗、稳定、吹打、过滤离心后将细胞接种于培养板和培养瓶中，以含20％胎牛血清的高糖DMEM培养基进行培养，取培养的第5-7天细胞用于测钙，待细胞培养至80％融合进行收集，用于RT-PCR实验。豚鼠ASMCs的鉴定：肌动蛋白荧光抗体检测豚鼠ASMCs。[Ca²⁺]i的测定：Fluo-3／AM的准备：细胞内钙荧光指示剂采用Fluo-3／AM1：200体积比将1mMFluo-3／AM用D-Hanks稀释为终浓度5×10 ^-6mol·L^-1，加入贴壁培养ASMCs的培养皿中负载。置于37℃、5％CO2培养箱中避光孵育30～60min，而后用PBS冲洗2次后，稳定15min，用倒置荧光显微镜及高灵敏度冷CCD数码摄像机采集细胞荧光图象，激发光波长488nm，发射光波长为528nm。应用Metafluo4.5分析软件进行图像处理时，对单个细胞进行图像分析。钙离子浓度的变化用AF／F₀的比值来表示，F₀为基础荧光密度值，F为给予不同工具药后细胞的荧光密度值，ΔF／F₀=（F-F₀）／F₀代表给药后钙离子的变化程度。豚鼠脑、骨骼肌和心肌的取材：豚鼠击头处死，无菌条件下迅速取骨骼肌、心肌和小脑组织分别作为RyR1、RyR2和RyR3的阳性对照，取出后的组织部分放入2 ml无菌Eppendof管中，向管内加入1 ml Trizol，用匀浆器充分匀浆后进行RNA提取。余下部分冻存于-70℃冰箱。豚鼠ASMCs中ayRs各亚型的mRNA表达：Trizol法提取总RNA，紫外分光光度计测RNA的纯度及浓度，然后进行cDNA的合成。引物序列是根据小鼠和大鼠的ayR1，RyR2和RyR3的cDNA设计的。各引物序列为RyR1：上游引物5’-GAAGGTTCTGGACAAACACGGG-3’，下游引物5’-TCGCTCTTGTTGTAGAATTTGCGG-3’，扩增产物435 bp；ayR2：上游引物5’-GAATCAGTGAGTTACTGGGCATGG-3’，下游引物5’-CTGGTCTCTGAGTTCTCCAAAAGC-3’，扩增产物635 bp；RyR3：上游引物5’-CCTTCGCTATCAACTTCATCCTGC-3’，下游引物5’-TCTTCTACTGGGCTAAAGTCAAGG-3’，扩增产物505 bp。β-actin：上游引物5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’，下游引物5’-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3’，扩增产物300 bp。引物由TaKaRa公司合成。以β-actin为内参。反转录体系为：总RNA1μg，参照试剂盒的说明加入其它试剂，最后为10μl体系。反转录后进行PCR反应。PCR反应体系：5×PCR缓冲液10μl，Taq酶0.25μl，上游和下游引物各为1μl，加无菌水补足体积50μl。反应条件：94℃预变性2 min，以94℃30 s，58℃30s，72℃2 min的顺序，共30个循环，最后72℃延伸5 min，产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶成像分析系统进行拍照、分析。统计学处理：采用SPSS 11.5，用两个独立样本的t检验对数据进行统计分析，显著性标准为P＜0.05，P＜0.01。全部数据均表示为（?）±s。实验结果1、在ASMCs外无钙情况下，不同浓度ryanodine(5×10^-5mol·L^-1，10^-4mol·L^-1，2×10^-4mol·L^-1)作用于原代培养正常与哮喘豚鼠ASMCs，[Ca²⁺]i迅速升高，哮喘组明显高于正常组（P＜0.01）。10^-4mol·L^-1的组织胺（histamine）作用于原代培养的正常组与哮喘组ASMCs，[Ca²⁺]i升高无明显差异（P＞0.05）。2、传代培养哮喘豚鼠ASMCs在10^-4、2×10^-4 mol·L^-1 ryanodine作用下，[Ca²⁺]i迅速升高，与原代细胞比较，无明显差异（P＞0.05）。在浓度为5×10^-5mol·L^-1时，原代明显高于传代（P＜0.01）。3、在正常豚鼠ASMCs中，RyR1和RyR2两种RyR亚型mRNA表达，且以RyR2的表达为主，未见RyR3的表达。4、在哮喘豚鼠ASMCs中，也只有RyR1和RyR2两种亚型表达，同样，以RyR2的表达为主，但哮喘时，RyR1的表达明显上调（P＜0.01）。讨论哮喘是一种以气道炎症，气道高反应性和气道重构为特征的慢性疾病。近年来，多数学者认为气道炎症是哮喘的中心性特征，随之导致气道高反应性和气道重构，而哮喘的临床特征主要为气道高反应性，气道高反应性可能与炎症、气道平滑肌、神经、遗传等多种因素有关，有文献报道气道炎症是哮喘患者气道高反应性的重要原因，但在无气道炎症时，仍可发生非特异性的气道高反应，如运动、冷空气诱导的哮喘，因此推断，气道高反应性可能与ASMCs收缩特性改变相关，其收缩性增强已经被广泛怀疑是哮喘发生气道高反应的重要原因。细胞内钙离子浓度是ASMCs维持其收缩特性的重要因素，钙离子浓度升高支气管平滑肌收缩增强，同时细胞内钙离子浓度升高也是支气管平滑肌敏感性升高的主要原因。细胞内钙离子浓度增高也促进气道平滑肌增生肥厚，导致气道狭窄可进一步加重气道高反应性。所以，哮喘与细胞内钙离子浓度升高存在重要的相关性。本实验主要就ASMCs内钙释放通道进行研究。采用分离培养的方法，原代培养了正常豚鼠和哮喘豚鼠的ASMCs，对细胞内钙离子浓度进行测定，推测ASMCs内钙释放通道的改变。本研究示豚鼠ASMCs对ryanodine具有反应性，哮喘时反应性更高，说明豚鼠ASMCs上存在RyRs，且与哮喘存在一定的关系。哮喘组SR上RyRs功能亢进，或因其敏感性升高，或RyRs水平上调，其机制需进一步研究。同时，本研究明确了正常与哮喘豚鼠ASMCs中只有RyR1和RyR2的表达，RyR3没有表达。并且，发现豚鼠ASMCs以表达RyR2为主。然而，哮喘时，RyR1的表达水平显著上调，RyR2没有明显的改变。我们的研究发现哮喘时细胞内钙离子浓度升高是由RyR的功能亢进引起，那么，这种功能亢进被进一步证实了主要是由于RyR1的表达水平上调所致。RyR1的变化可能导致细胞内钙释放的过程发生改变，最终使细胞内钙离子浓度升高，引起哮喘症状。这就证明了豚鼠ASMCs中RyRs与哮喘的发生存在密切相关性的观点。RyR1的上调可能是引起哮喘的发病机制之一。结论1、哮喘豚鼠ASMCsryanodine受体内钙释放功能升高。2、特定条件下，哮喘传代细胞仍然保持原代细胞内钙释放通道的特性。3、豚鼠ASMCs中只有RyR1和RyR2两种亚型表达。4、哮喘豚鼠ASMCs中也只有RyR1和RyR2两种亚型表达。且哮喘时RyR1表达上调，提示细胞内钙释放通道RyR1与哮喘疾病存在重要相关性。