【摘 要】
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目的肝卵圆细胞的上皮间质转化（EMT）与肝癌前病变密切相关。本研究以转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导大鼠肝卵圆细胞WB-F344发生EMT为模型,探究Wnt/β-catenin信号通路在此过程中的调控作用。在此基础上,加入鳖甲煎丸含药血清,进一步探究鳖甲煎丸是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路来逆转EMT达到抗肝癌前病变的作用。方法1.以TGF-β1诱导WB-F344细胞EMT,W
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（81774037）；
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目的肝卵圆细胞的上皮间质转化（EMT）与肝癌前病变密切相关。本研究以转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导大鼠肝卵圆细胞WB-F344发生EMT为模型,探究Wnt/β-catenin信号通路在此过程中的调控作用。在此基础上,加入鳖甲煎丸含药血清,进一步探究鳖甲煎丸是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路来逆转EMT达到抗肝癌前病变的作用。方法1.以TGF-β1诱导WB-F344细胞EMT,Western blot法检测EMT相关标志物蛋白的表达水平。2.以Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV-939作用于EMT的WB-F344细胞,划痕实验、细胞免疫荧光、Western blot法分别检测细胞迁移能力、Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白及EMT相关标志物蛋白的表达水平。3.以鳖甲煎丸含药血清作用于EMT的WB-F344细胞,划痕实验、细胞免疫荧光、qPCR、Western blot法分别检测细胞迁移能力、Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白及EMT相关标志物mRNA、蛋白的表达水平。结果1.TGF-β1刺激WB-F344细胞4d后,细胞间隙增大,细胞形态从鹅卵石状向成纤维样细胞转变;且E-cadherin蛋白表达降低（P<0.01）,N-cadherin蛋白表达升高（P<0.01）;说明TGF-β1成功诱导WB-F344细胞EMT改变。2.以TGF-β1诱导WB-F344细胞4 d为模型组。与空白组比较,TGF-β1模型组β-catenin蛋白荧光表达增强,并在胞质内积聚入核,β-catenin、p-GSK3β蛋白表达水平升高（P<0.01）;细胞迁移能力增强,E-cadherin蛋白表达水平降低,N-cadherin、Vimentin 蛋白升高（P<0.01）。与 TGF-β1 模型组比较,XAV-939 组β-catenin蛋白荧光表达减弱,β-catenin、p-GSK3β蛋白表达水平降低（P<0.01）;细胞迁移能力减弱,E-cadherin蛋白表达水平增加,N-cadherin、Vimentin蛋白降低（P<0.01）;各组GSK3β蛋白差异无统计学意义。说明抑制Wnt/β-catenin信号通路可逆转WB-F344细胞EMT及迁移能力。3.与TGF-β1模型组比较,鳖甲煎丸低、中、高剂量组、复方鳖甲软肝片组β-catenin蛋白荧光表达减弱,β-catenin、p-GSK3β蛋白表达水平降低（P<0.01）,各组GSK3β蛋白表达差异无统计学意义;鳖甲煎丸中、高剂量组、复方鳖甲软肝片组细胞的迁移能力减弱（P<0.05）;E-cadherinmRNA及蛋白表达水平升高,N-cadherin mRNA及蛋白表达水平降低（P<0.05）,鳖甲煎丸中、高剂量组Vimentin蛋白表达水平降低（P<0.05）,说明鳖甲煎丸可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路逆转WB-F344细胞的EMT改变。结论1.TGF-β1可诱导WB-F344细胞EMT;TGF-β1通过促进胞质中p-GSK3β表达,抑制GSK-3β的活性,从而抑制由GSK3β、APC等组成的蛋白复合物介导的β-catenin磷酸化降解,导致β-catenin在细胞质内积聚并入核,激活Wnt/β-catenin 信号通路。2.抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活可逆转WB-F344细胞EMT及迁移能力。3.鳖甲煎丸通过抑制p-GSK3β的表达,稳定GSK3β等组成的蛋白复合物的活性以促进β-catenin磷酸化降解,抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活,进而逆转WB-F344细胞EMT及迁移能力。综上所述,Wnt/β-catenin信号通路参与调控WB-F344细胞EMT过程,鳖甲煎丸可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活,逆转WB-F344细胞EMT及迁移能力,从而达到抗肝癌前病变的作用,为其临床应用提供充分的理论依据。
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