转运体是位于细胞膜表面的膜蛋白，广泛分布于机体各组织，具有重要的生理作用。某些转运体可以通过调控药物进出细胞而影响药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程，影响药物处置;同时，其活性也可能会受到药物的影响，进而影响转运体内源性底物或者同服药物的处置，扰乱内源物的动态平衡或改变同服药物的药动学行为，产生毒性。药物转运体研究有助于阐明药物处置机制，揭示药物引起肝损伤的机制，合理指导临床安全用药和新药开发。　　本论文以血卟啉单甲醚（光动力学新药）和TAK-875（抗糖尿病药物，止步于临床Ⅲ期）为研究对象，利用各种体内外模型，分别阐明其体内处置机制和引起肝损伤的机制，为临床安全用药和新药开发提供借鉴。　　1.转运体介导的血卟啉单甲醚处置机制研究　　血卟啉单甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether, HMME)是由上海复旦张江生物有限公司研发的新型卟啉类光动力学药物，用于治疗鲜红斑痣。HMME含有两个等量的同分异构体HMME-1和HMME-2，临床上静脉推注给药。前期大鼠和人体研究表明，HMME主要以原形形式经胆汁/粪快速排泄，12h内大鼠平均胆汁回收率约为81.8％，推测肝脏在HMME处置中具有重要作用。HMME单体的血浆清除存在选择性，HMME-2清除较HMME-1快。HMME在生理条件下主要以阴离子形式存在，难以通过被动扩散快速进出肝细胞，推测肝细胞上的转运体参与其体内处置过程。本研究的目的为鉴定参与HMME进出肝细胞的摄取转运体和外排转运体，探索血浆清除选择性的机制，考察转运体抑制剂对HMME处置的影响。　　采用分别转染有OATP1B1、OATP1B3和OATP2B1转运体的HEK293细胞进行摄取研究发现，HMME-1和HMME-2均为OATP1B1、OATP1B3和OATP2B1的底物。为鉴定参与HMME摄取进入肝细胞的主要转运体表型，实验考察了HMME和HMME单体在OATP转染细胞和冻存人肝细胞中的摄取。HEK293-OATP1B1、HEK293-OATP2B1细胞和冻存人肝细胞对HMME-2的摄取速率约为HMME-1的2.3-6.9倍，而HEK293-OATP1 B3细胞对HMME-1的摄取速率约为HMME-2的1.5倍，因此从单体摄取选择性的角度排除OATP1B3作为主要摄取转运体表型的可能性。OATP1B1对HMME-2的亲和性高于HMME-1，其‰值分别为0.63μM和5.61μM;人肝细胞对HMME-1和HMME-2的亲和性与OATP1B1相近，提示OATP1B1可能是主要的转运体表型。OATP抑制剂利福平能够显著抑制OATP1B1和OATP1B3转运HMME，不能抑制OATP2B1转运HMME，而替米沙坦可以抑制OATP1B1、OATP1B3和OATP2B1介导的HMME转运。通过比较利福平和替米沙坦对人肝细胞摄取HMME单体抑制能力的差异，实验发现OATP2B1对HMME转运的贡献小于20％，进一步证实OATP1B1是HMME肝摄取的主要转运体表型。OATP1B1对HMME-2的相对快速摄取导致HMME-2血浆暴露量低于HMME-1，造成HMME单体血浆清除的选择性。OATP1B1具有基因多态性，其活性也可能会受到其他药物的影响，临床上需关注由OATP1B1所引起的HMME药动学的个体差异或药物-药物相互作用。　　鉴于HMME的低渗透性，推测有外排转运体参与其胆汁排泄过程。Caco-2细胞、MDCKⅡ-MDR1、MDCKⅡ-BCRP和MDCKⅠ-MRP2细胞转运实验表明HMME-1和HMME-2均为P-gp、BCRP和MRP2的底物。P-gp强抑制剂GF120918能够显著抑制P-gp转运HMME，而BCRP和MRP2强抑制剂KO143和MK571则不能抑制HMME转运。芹菜素能够强抑制P-gp和BCRP转运HMME，非洛地平和槲皮素可以分别抑制BCRP和MRP2转运HMME。为探索可能的转运抑制机制，我们采用分子对接技术考察了HMME单体与P-gp、BCRP和MRP2的相互作用。HMME单体均可以通过与氨基酸残基形成氢键作用结合在转运体蛋白跨膜区，两者的低能优势构象几乎重叠。HMME与转运体的结合模式与很多转运体已知底物(如P-gp底物伊马替尼和伊立替康、BCRP底物血卟啉和MRP2底物E217βG)相同，由此推测HMME是P-gp、BCRP和MRP2的底物。P-gp抑制剂GF120918、P-gp/BCRP芹菜素和MRP2抑制剂槲皮素在转运体跨膜腔中的分子走势与HMME一致，均可以与跨膜腔中氨基酸残基形成氢键作用，提示上述抑制剂可能会与HMME竞争结合位点，从而影响转运体转运HMME。KO143和MK571在跨膜腔中的分子走势与HMME不同，推测可能不会影响HMME与转运体的结合，一定程度上解释了KO143和MK571不能抑制BCRP和MRP2转运HMME的现象。　　新鲜分离的大鼠肝细胞实验表明HMME是大鼠Oatps的底物。HMME与Oatp抑制剂利福平共同给药时，大鼠体内HMME-1和HMME-2的血浆Cmax值分别提高13％和47％，AUC分别显著提高69％和115％，导致两单体Cmax的比值从1.5降低到1.1，AUC的比值从1.98降低至1.56。利福平显著降低了约40-50％的HMME-1和HMME-2的清除率。在胆汁排泄实验中，0-10 min时间段内对照组中HMME-1和HMME-2的胆汁排泄累积量分别是利福平组的6.81倍和8.00倍，2h内HMME的胆汁回收率从60.8％降低至48.7％。利福平抑制实验表明Oatps在HMME选择性药动学和排泄中具有重要作用。　　有文献报道P-gp抑制剂GF120918也是OATP/Oatp抑制剂，本实验中GF120918不影响大鼠肝细胞摄取HMME，MRP2抑制剂槲皮素则强抑制Oatps摄取HMME。大鼠麻醉状态下给予BCRP抑制剂非洛地平后由于低血压死亡，因此动物实验中仅考察了P-gp抑制剂GF120918对HMME大鼠胆汁排泄的影响。GF120918与HMME共同给药时，0-2 h内HMME-1和HMME-2的胆汁回收率降低约10％，不具有显著差异，这可能与BCRP和MRP2转运体的代偿转运作用有关。　　大鼠肝细胞三明治(SCRH)模型中观察到HMME-1的胆汁排泄指数(BEI)值大于HMME-2，提示肝细胞中HMME-1胆汁排泄较HMME-2快;这一现象与大鼠胆汁排泄实验中观察到的HMME-1胆汁排泄速率大于HMME-2相一致。目前尚不清楚是哪种外排转运体引起的HMME单体胆汁排泄速率差异。　　2.转运体介导的TAK-875引起肝损伤机制研究　　TAK-875是由日本武田公司研发的一种选择性GPR40激动剂，用于治疗2型糖尿病，但是其由于肝脏安全性顾虑在2013年终止于临床Ⅲ期试验。2型糖尿病患者连续24周口服50 mg TAK-875后，出现肝功能异常、胆石症、谷丙转氨酶(ALT)升高等现象，提示TAK-875引起了肝损伤，但是引起肝损伤的机制目前尚不清楚。临床研究显示，TAK-875血浆消除较慢，血浆消除半衰期t1/2约28.1-36.6 h;糖尿病患者TAK-875消除更慢，连续给药后存在蓄积现象。胆汁淤积型肝损伤是常见的药物引起的肝损伤类型，通常与胆汁酸和胆红素等内源性物质在肝脏内的高浓度累积有关。胆汁酸和胆红素体内转运过程中涉及多种摄取转运体和外排转运体，本研究的目的是考察TAK-875对胆汁酸和胆红素肝胆转运中相关转运体的抑制作用，评估TAK-875对胆汁酸和胆红素转运的影响，探索TAK-875引起肝损伤的可能机制。　　尾静脉单次给予SD大鼠高剂量(100 mg/kg) TAK-875后4h内，大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酯酶(ALP)的浓度与对照组无显著差异;血清中总胆汁酸(TBA)水平显著提高约3-4倍，总胆红素(TBIL)水平显著提高约1.5-2.6倍，其中胆酸(CA)、熊去氧胆酸(UDCA)和牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)的浓度有显著升高。尾静脉给予SD大鼠100 mg/kgTAK-87524 h后，大鼠肝细胞出现细胞核固缩，胆管区域观察到胆管扩张现象;结合血清生化指标变化，推测TAK-875可能会造成大鼠胆汁淤积型肝损伤。灌胃或静脉给予SD大鼠TAK-875后，肝脏中TAK-875浓度约为血浆的3倍;如果该比例关系可以推至人体，那么2型糖尿病患者连续14天服用50 mg TAK-875后，肝脏内浓度约30μM，该浓度可能随服药时间的延长而继续升高。在该浓度下TAK-875是否会通过抑制转运体转运胆汁酸和胆红素，引起胆汁淤积型肝损伤呢？　　为了解决这一问题，我们首先在SCRH中考察了TAK-875对d8-TCA和CDF转运的影响。d8-TCA经肝细胞基底侧的Na+依赖型NTCP转运体（主要途径）和非Na+依赖型OATP转运体（次要途径）摄取进入肝细胞，经肝细胞顶膜侧的BSEP转运体外排至胆汁。20μM TAK-875可以显著降低大鼠肝细胞和胆小管中d8-TCA的累积，导致其表观胆汁清除率(CLbile，app)降低到不足对照组的10％，提示TAK-875抑制了基底侧摄取转运体和/或顶膜侧外排转运体。20μM和100μM TAK-875使得d8-TCA的BEI值分别降低至对照组的70％和52％，BEI值表征被外排至胆汁的d8-TCA占进入肝细胞的d8-TCA总量的百分比，提示TAK-875抑制Bsep转运体介导的胆汁酸外排过程。临床上引起胆汁淤积型肝损伤的药物如曲格列酮、波生坦和格列本脲等，均是BSEP/Bsep的抑制剂。　　SCRH中TAK-875处理后的肝细胞裂解液中d8-TCA的总量降低至对照组的28.7％，提示TAK-875抑制了d8-TCA的肝摄取过程。大鼠肝细胞、HEK293-OATP转染细胞和MDCKⅡ-NTCP转染细胞实验结果显示，TAK-875对OATP/Oatps转运体的抑制能力(IC50为2-4μM)强于NTCP/Ntcp(IC50分别为27.2μM和10.9μM)。TAK-875对人源NTCP的相对弱抑制作用，提示TAK-875对胆汁酸摄取进入人肝细胞的过程影响较小，此时TAK-875可能会通过抑制BSEP转运体使得肝细胞内胆汁酸浓度高度累积，产生胆汁淤积型毒性。　　肝细胞中的CDF经顶膜侧的MRP2/Mrp2外排至胆小管或经MRP3/Mrp3外排至培养基，荧光显微镜下观察到TAK-875显著降低SCRH中CDF在胆小管中的累积，高浓度下大大提高CDF在肝细胞中的浓度，提示TAK-875抑制了Mrp2和Mrp3转运过程。MDCKⅠ-MRP2细胞转运实验证实TAK-875可以抑制MRP2转运体转运长春碱，其IC50值为2.41μM。血清中胆红素主要经OATP1B1和OATP1B3摄取进入肝细胞，在肝细胞中以葡糖醛酸结合物形式通过MRP2外排至胆汁。TAK-875对OATP1B1、OATP1B3、MRP2和MRP3的抑制作用，提示TAK-875可以影响血红素的转运过程，减少胆红素的胆汁排泄，提高血浆和肝脏中胆红素的浓度，可能会引起高胆红素血症。　　3.结论　　本论文以新型光动力学药物HMME和选择性GPR40激动剂TAK-875为研究对象，揭示了转运体在其药物处置和产生毒性中的作用机制。　　本研究证明HMME经肝细胞基底侧的OATP/Oatp摄取转运体进入肝细胞，其中OATP1B1是主要的摄取转运体表型，其介导的HMME-2摄取速率大于HMME-1，导致血浆中HMME-1消除较HMME-2快。OATP/Oatp抑制剂利福平可以显著提高血浆中HMME单体的暴露量，缩小两者差异，并减慢胆汁排泄速率。HMME也是顶膜侧外排转运体P-gp、BCRP和MRP2的底物，推测P-gp、BCRP和MRP2参与HMME胆汁快速排泄过程，该转运过程可能会被GF120918、钙离子通道抑制剂、蛋白激酶抑制剂以及部分黄酮类药物所抑制。OATP1B1以及BCRP转运体等具有基因多态性，其活性也可以受到其他药物的影响，因此在临床用药时需特别关注基因多态性和同服药物所引起的HMME药动学的改变，减少发生皮肤光毒性副作用的风险。　　本研究也证明了TAK-875可以通过抑制肝细胞表面的NTCP/Ntcp、OATP/Oatp、MRP2/Mrp2和Bsep转运体，影响内源性物质胆汁酸和胆红素的转运，提高血浆中胆汁酸和胆红素的浓度。糖尿病人长期服用TAK-875后，血浆和肝脏中长时间高浓度的TAK-875累积，推测会通过抑制胆汁酸和胆红素的肝胆转运，减少胆汁酸和胆红素的胆汁排泄，提高血浆和肝细胞内的浓度，产生胆汁淤积和高胆红素血症，这可能是TAK-875临床出现肝损伤的原因之一。　　本论文结果提示，某些转运体在药物体内处置和药物引起的肝损伤中发挥了重要作用。在药物发现和开发阶段需关注药物与转运体的相互作用，临床上应谨慎对待联合用药，以免发生不良反应。