肝内胆管细胞癌(Intrahepatic Cholangiocarcinoma, ICC)是一种具有胆管上皮特性的的肝内原发性恶性肿瘤,肝内胆管细胞癌作为发病率第二的原发性肝癌(Primary liver cancer, PLC),约占10-15%,仅次于肝细胞性肝癌。近二十年来肝内胆管细胞癌发病率在世界范围内有明显升高,特别是东南亚地区。目前手术切除仍是肝内胆管细胞癌首选且最有效的治疗方法,但是,即使能够手术切除肿瘤的患者,由于术后早期复发、肿瘤生长迅速及远处转移等原因,预后也很差,患者3年和5年生存率只有30%和18%。因此,探悉肝内胆管细胞癌复发及转移过程中的分子机制,筛查新的关键分子,对提高肝内胆管细胞癌患者的预后判断准确性及开发新的治疗靶点有着重要的临床现实意义。钙蛋白酶(Capn)是一类有着相似催化结构域的性质保守的半胱氨酸蛋白酶,催化众多特殊的基质调控蛋白水解。钙蛋白酶参与体内一系列细胞基本生理过程,包括细胞骨架重建,胞内信号转导,细胞的增殖及凋亡等。已知钙蛋白酶系统在超过12种哺乳动物体内存在。相关研究证实钙蛋白酶在乳腺癌,子宫内膜癌和胰腺癌等一系列肿瘤的发生发展过程起着重要的调控作用。钙蛋白酶家族包含十余种亚基,Capn1和Capn2的组织表达最为广泛,因而最受关注。Capn1和Capn2根据体外激活所需的钙离子浓度命名,和调节亚基Capn4 (28kDa)结合成异构二聚体形式发挥其生理功能,其中Capn1只需要微摩尔级的钙离子浓度就可以被激活而发挥作用。近期研究表明,钙蛋白酶表达与肿瘤的发生发展过程密切相关,研究发现神经鞘瘤、脑膜瘤和肾细胞癌肿瘤组织中Capn1表达均明显升高,同时,在子宫内膜癌组织中检测到钙蛋白酶抑制蛋白表达降低。到目前为止,Capn1在肝内胆管细胞癌发生发展过程中的表达改变及其作用未见报道。本研究通过检测140肝内胆管细胞癌患者癌组织和对应正常肝脏组织中Capn1、E-cadherin及Snail的表达,并且利用组织芯片技术分析验证了Cap n1表达异常与患者临床病理参数及预后间的相关性,探讨Capn1是否为肝内胆管癌患者的预后的预测指标。通过SiRNA干扰技术下调肝内胆管肿瘤细胞系中Capn1的表达,观察肝内胆管癌细胞的侵袭转移潜能的改变,阐明其对肝内胆管癌细胞的生物学特性的影响,进而,通过研究Capn1对上皮间质转化相关蛋白E-cadherin和Snai1表达的影响,对Capn1调控肝内胆管癌的侵袭转移机制进行了初步的探讨。第一部分Capn1及EMT指标在肝内胆管细胞癌中的表达及其相关性的研究目的：研究Capn1及E-cadherin、Snail在肝内胆管细胞癌组织和对应的癌旁肝脏组织中的表达情况,探讨Capn1与EMT标志物细胞黏附分子上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)和间质相关蛋白S nail在肝内胆管细胞癌中的表达及其相关性。方法：应用免疫组化方法检测140例肝内胆管细胞癌患者病理组织中Capn1、Snail和E-cadhrein的表达：应用western blot方法检测四组肝内胆管细胞癌组织Capn1的表达：应用SPSS16.0进行统计学分析。结果：western bolt及免疫组化学结果均显示在肝内胆管细胞癌组织中,Capn1表达高于癌旁组织,两者间差异有统计学意义(p<0.05)；早期复发病人Capn1表达较未复发组患者明显升高,差异有统计学意义(p<0.05);免疫组化结果显示Snai1在癌组织中的表达明显高于癌旁组织,而E-cadheri n在癌组织中的表达低于癌旁组织。结论：Capn1、Snail在肝内胆管细胞癌组织中表达上调,而E-cadherin在肝内胆管细胞肿瘤中表达下调；Capn1与Snail、E-cadherin之间具有显著相关性(p<0.05)；早期复发患者肿瘤组织中Capn1表达升高。第二部分Capn1与肝内胆管细胞癌临床病理特征的关系及其与EMT诊断预后的价值目的：通过免疫组化方法检测Capn1、E-cadherin及Snail在肝内胆管细胞癌组织中的表达,探讨Capnl与肝内胆管细胞癌临床病理特征的关系及其与E-cadherin Snail的预后意义。方法：应用免疫组化方法检测140例肝内胆管细胞癌病理组织中Capn1、E-cadherin及Snail的表达,探索Capn1与临床病理特征的关系及其与E-cadherin、Snail预后诊断价值。结果：Capn1高表达与肝内胆管细胞癌患者的血清CA19-9表达及肿瘤数目相关(p<0.05)。Capn1、Snail高表达组术后总体生存率明显低于Capnl低表达组(p<0.05),累计复发率明显高于Capn1低表达组(p<0.05)；E-cadherin高表达组术后总体生存率高于Capnl低表达组而复发率低于Capn1低表达组。单因素及多因素分析显示Capn1、E-cadherin及Snail 表达是患者总体生存率和累计复发率的独立预后因子。结论：Capn1在肝内胆管细胞癌组织及早期复发患者的肿瘤组织表达中升高,与肝内胆管细胞癌的CA19-91表达及肿瘤TNM分期相关(p<0.05)。肿瘤组织Capnl、Snail高表达及E-cadherin低表达患者其总体生存率更低,且术后早期复发几率更高。Capn1、E-cadherin及Snail在肿瘤组织中的表达差异具有预后诊断价值。第三部分Capn1表达对肝内胆管细胞癌细胞侵袭转移潜能的影响及其分子机制目的：探讨Capn1表达改变与肝内胆管癌细胞侵袭转移潜能的关系,并探索Capnl调控肝内胆管癌上皮间质转化的机制。方法：应用RNA干扰下调Capn1在肝内胆管细胞癌细胞株中的表达,并且验证干扰效率。应用划痕试验检测细胞迁移能力变化,transwell试验检测细胞侵袭能力变化,MTT试验检测细胞增殖能力的变化。利用western blot技术进一步探究Capn1表达调控肝内胆管癌上皮间质转化关键分子改变。结果：RNA干扰下调肝内胆管癌细胞株QBC939口RBE中Capn1表达,发现干扰组细胞迁移与侵袭能力、增殖能力较对照组明显减弱(p<0.05),Capn1的表达改变与间质相关蛋白Snai1呈正相关而与上皮相关蛋白E-cadherin呈负相关。结论：Capn1高表达与肝内胆管癌细胞的侵袭迁移、增殖能力正相关,并且Capn1的表达改变及Snai1表达呈正相关,与E-cadherin表达呈负相关。