拟南芥HEN1调控胚珠发育的分子机理研究

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有性生殖作为植物整个生命周期的关键环节,对于植物后代的繁衍和世代交替的发生至关重要。以模式植物拟南芥为例,植物的有性生殖过程大致可以分为雌雄生殖器官的形成、受精和胚胎发生三个阶段。胚珠作为植物主要雌性生殖器官,是受精发生的场所,因此受到人们的广泛关注。近年来,高通量数据表明microRNA作为一种重要的调控因子在胚珠发育过程中发挥着重要作用。此外已有报道表明与microRNA的产生相关的蛋白AGO9和DCL1分别参与调控功能大孢子的形成和珠被的发育。但microRNA加工途径中的其他成员在有性生殖方面的功能尚未报道。本论文利用反向遗传学手段进行研究,研究数据表明HEN1通过miR167负调控ARF6和ARF8参与调控胚珠发育。本论文的实验结果和主要结论如下:(1)hen1-8雌雄配子体传代率正常已有研究表明HEN1突变后导致角果结实率降低,但并未对该表型做详细分析。因此,我们首先对hen1-8进行角果分析,结果发现hen1-8的结实率只有25%左右,而其杂合体结实率正常。此外,杂合突变体与野生型正反交分离比正常。这些结果表明hen1-8雌雄配子体均能够正常传代。(2)hen1-8珠被发育异常为了探究hen1-8的雌、雄性孢子体哪一方出现异常,我们将野生型和hen1-8互交,结果发现当hen1-8作父本时,结实率正常;而当hen1-8作母本时,结实率只有55%,表明hen1-8的雌性孢子体异常。为了研究hen1-8胚珠在哪一发育时期开始出现异常,我们做了光切实验;结果发现hen1-8胚珠发育早期正常,而当发育至3-I期时,珠被出现了明显的发育滞后的现象,表明HEN1突变后影响胚珠珠被的发育。(3)hen1-8胚珠对花粉管的吸引能力降低我们将转基因材料ProLat52:GUS花粉授粉hen1-8雌蕊,授粉12 h后染色观察胚珠对花粉管的吸引情况。结果显示,野生型中有81.1%左右的胚珠吸引了花粉管,而突变体中只有47.4%左右;48 h的苯胺蓝染色结果显示野生型和hen1-8中受精后发育的胚珠比例分别为96.6%和56.5%。这些结果表明HEN1突变后胚珠对花粉管的吸引能力降低,进而导致育性降低。(4)HEN1负调控ARF6和ARF8的表达已有的研究表明miR167通过调控ARF6和ARF8的表达进而影响胚珠发育,而miR167又受到HEN1的调控。因此我们检测了hen1-8胚珠中ARF6和ARF8的表达水平,发现二者均有显著升高,且原位杂交结果显示ARF6和ARF8在hen1-8成熟胚珠中均出现了异位表达的现象,表明HEN1通过miR167负调控ARF6和ARF8的表达进而调控胚珠发育。
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