患刺激隐核虫病卵形鲳鲹的继发细菌疾病研究

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卵形鲳鲹是我国南方深水网箱养殖的主要海水经济鱼类,每年8-10月份均会爆发刺激隐核虫病,并伴随继发细菌感染,一旦管控不当,常常导致卵形鲳鲹大规模死亡,造成严重的经济损失,成为制约卵形鲳鲹养殖产业发展的主要障碍之一。国内外已对刺激隐核虫与宿主的相互作用进行了大量研究,但卵形鲳鲹在感染刺激隐核虫期间,伴随发生的继发细菌感染,其细菌病原种类以及来源,尚未进行系统全面研究。因此,本研究对患刺激隐核虫病卵形鲳鲹肝脏中的继发细菌感染病原进行分离鉴定,并利用组织病理学、免疫学及宏基因组学对继发细菌感染病原来自于内源的可能性进行了探讨,研究结果如下:1.患刺激隐核虫病卵形鲳鲹肝脏内继发感染细菌的分离鉴定无菌条件采集卵形鲳鲹肝脏组织,利用组织匀浆梯度稀释平板涂布法检测患刺激隐核虫病卵形鲳鲹肝脏组织的载菌量,对分离获得的优势菌进行纯化和鉴定,结果显示:卵形鲳鲹患刺激隐核虫为轻度时,即体表未见溃烂,摄食和游泳表现正常,鱼体未见死亡,采集三批共28尾样品,肝脏中可以检测到细菌的个体数量所占比重为92.9%,三批样品CM20190717、CM20190730和CM20191008肝脏载菌量分别为7.67(±0.22)×10~4、8.56(±0.24)×10~3和1.86(±0.16)×10~4CFU/g;卵形鲳鲹患刺激隐核虫病为中度时,即体表一些部位可见轻微程度的溃烂,摄食量减少,游泳不正常,开始出现少量死亡的情况,采集两批共10尾样品,肝脏中可以检测到细菌的个体数量所占比重为70%,两批样品LAB20181120和LAB20190630肝脏载菌量分别为4.68(±0.26)×10~6和8.03(±0.13)×10~6CFU/g;卵形鲳鲹患刺激隐核虫病为重度时,即体表多处可见明显溃烂,摄食量减少甚至停食,游泳不正常,出现大量死亡,采集三批共17尾,肝脏中可以检测到细菌的个体数量所占比重为88.2%,LAB20190720和LG20190929肝脏载菌量分别为3.52(±0.13)×10~7和9.07(±0.23)×10~7CFU/g。卵形鲳鲹患刺激隐核虫病后,随着疾病症状加重其肝脏组织单位载菌量逐渐加大,且存在显著性差异(P<0.01)。继发细菌感染病原分离结果显示,8批55尾患刺激隐核虫病卵形鲳鲹肝脏中共分离出93株细菌,16S rRNA基因序列扩增和比对显示继发感染病原包含9个属17种细菌。不同批次样品分离获得的优势菌可分为两种:(1)同批样品中不同个体分离获得优势菌基本不同,共6批,占总批次的75%,包括CM20190717、CM20191008、LAB20181120、LAB20190630、LAB20190720和LG20190929;(2)同批样品不同个体中分离获得的优势菌种类基本相同,占总批次的25%,包括CM20190730和CM20190826,其主要优势致病菌分别为表皮葡萄球菌和哈维氏弧菌。2.刺激隐核虫感染对卵形鲳鲹肝脏及肠道组织的影响采用组织切片、HE染色和显微观察的方法,研究了卵形鲳鲹患刺激隐核虫病肝脏和肠道组织病理变化,切片结果显示:刺激隐核虫感染对肝脏和肠道组织造成了损伤,随着刺激隐核虫感染后时间的延续,肝脏和肠道组织的损伤程度加剧,在第二轮感染结束时,肝脏和肠道组织损伤严重。通过检测非特异性免疫指标来反映肝脏功能的变化,结果显示:患刺激隐核虫病后,卵形鲳鲹肝脏的非特异性免疫功能显著降低(P<0.05)。采用高通量测序方法,对患刺激隐核虫病卵形鲳鲹肠道菌群进行研究,结果表明:患刺激隐核虫病后肠道菌群组成在各分类水平上均发生改变,肠道微生物多样性、丰富度和均匀度均有所下降,肠道菌群失衡。卵形鲳鲹受到刺激隐核虫感染后,其肠道菌群失衡,免疫力下降,肠道和肝脏组织出现病变,具有发生肠道菌群移位的可能性,卵形鲳鲹感染刺激隐核虫后所发生的继发细菌感染,病原可能来自于肠道。
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