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背背多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种恶性浆细胞疾病,在血液系统恶性肿瘤中排行第二,其具体发病机制尚不明确。与传统化疗相比,新药及造血干细胞移植(HSCT)、CAR-T的应用使MM患者长期生存得到了显著提升。但随着疾病的发生发展,多数患者发生耐药和复发,因此MM目前仍不能治愈,其治疗仍存在挑战和争议。KRAB锌指蛋白(KRAB-ZFPs)是机体中被发现的分布最广的转录因子家族。ZNF382(zinc-finger protein 382)是KRAB-ZFPs蛋白家族的成员之一,定位于19p13.12,具有一个KRAB结构域。已有研究证实ZNF382可在多种恶性肿瘤中发挥抑癌基因的作用,且由于其启动子Cp G岛发生高频甲基化使之在这些肿瘤中表达下调。但ZNF382的具体抑癌分子机制尚不明确,尤其在MM中的表观遗传学改变、生物学功能仍然未知。因此,本课题主要检测MM中ZNF382基因启动子区的甲基化状态,并对其在MM中的生物学功能进行初步探讨。目的本研究主要检测ZNF382在MM及其细胞株U266中的表达、甲基化状态,探讨ZNF382启动子区甲基化状态与MM患者临床病理特征的相关性,应用去甲基化药物地西他滨(decitabine,DAC)进行处理,检测DAC对ZNF382表达及启动子区甲基化状态的影响,并进一步通过过表达ZNF382探讨ZNF382对MM细胞增殖、凋亡能力等生物学功能的影响。方法1.收集MM患者骨髓单个核细胞(MM-BMMNC)和临床资料,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(WB)检测ZNF382在MM-BMMNC和正常对照组骨髓单个核细胞(N-BMMNC)中m RNA及蛋白水平的表达。采取RT-PCR和WB验证MM细胞株U266中ZNF382基因m RNA及蛋白的表达。2.应用甲基化特异性PCR(MSP)检测MM-BMMNC、N-BMMNC和U266中ZNF382基因启动子区甲基化状态,并探讨启动子甲基化状态与MM患者病理特征之间的关系。同时,应用去甲基化药物DAC处理MM细胞株U266,通过RT-PCR和MSP检测DAC对ZNF382基因启动子区甲基化状态及表达的影响。3.应用ZNF382过表达慢病毒包装系统转染人胚肾上皮细胞(293T),制备过表达ZNF382的慢病毒颗粒;将其感染U266细胞,并采用嘌呤霉素(Puromycin)法进行筛选,应用RT-PCR和WB鉴定ZNF382稳定过表达细胞株。应用CCK-8及流式细胞术分析各组细胞的增殖和凋亡情况,探讨ZNF382在MM中发挥的生物学功能。结果1.与N-BMMNC相比,ZNF382在MM-BMMNC中的m RNA和蛋白表达水平均有不同程度的下调或沉默(P<0.05),ZNF382在MM细胞株U266中的m RNA及蛋白表达水平也出现明显下降(P<0.05)。2.MSP实验分别检测23例MM-BMMNC与9例N-BMMNC中ZNF382基因启动子区甲基化状态,结果提示43.48%的MM-BMMNC存在ZNF382基因启动子区异常高甲基化,而N-BMMNC中的发生率只有11.11%,此外ZNF382基因启动子区甲基化频率与MM疾病分期相关(P<0.05)。U266中ZNF382基因启动子区甲基化水平明显升高,应用去甲基化药物DAC处理后,U266中ZNF382基因启动子区甲基化水平较前降低,m RNA表达水平较前有所恢复。3.成功获得ZNF382过表达慢病毒颗粒,同时感染U266细胞。结果提示,过表达ZNF382能显著抑制U266细胞增殖并促进其凋亡(P<0.05)。结论本研究表明与N-BMMNC相比较,ZNF382在MM-BMMNC及其细胞株U266中的表达水平降低、启动子区甲基化频率增加,且启动区甲基化频率与MM患者疾病分期呈负相关;去甲基化药物DAC可降低MM细胞ZNF382启动子区甲基化水平并部分恢复ZNF382表达;ZNF382能在MM细胞中发挥抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的生物学功能。综上所述,ZNF382在MM中可能发挥抑癌基因的作用,并影响MM的生物学功能,有望通过进一步研究为MM未来的靶向性治疗提供一定的理论依据。