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研究背景:白血病是严重危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤,迄今白血病的治疗仍主要采用传统的大剂量联合化疗,但此疗法副作用大,复发率高,而且对正常机体免疫与造血系统有极大的损害。中药多糖能非特异性地增强机体的免疫功能,提高化疗、放疗的抗癌效应及减少其副作用。近年来,中药多糖的免疫调节活性及抗肿瘤作用倍受关注,成为中药多糖研究的重要课题。人参(Panax Ginseng C.A.Meyer)作为祖国传统医学的“补气”要药,已有数千年的临床应用历史,人参多糖(Ginseng polysaccharide,GPS)是人参的主要有效药物成分之一。传统中医理论认为:人参有“补气生血,扶正祛邪”之功效。我们既往研究表明:GPS是人参中促进血细胞发生的有效成分,GPS对小鼠多能造血干细胞(CFU-S)、人与小鼠造血祖细胞(BFU-E、CFU-GM、CFU-MK、CFU-E等)的增殖分化有显著刺激作用。同时,GPS能够抑制人早幼粒白血病细胞株HL-60的增殖,对移植性人白血病模型小鼠也有显著疗效。巨噬细胞(macrophages, MФ)是机体内具有多种功能的重要免疫细胞,可通过处理抗原和释放可溶性因子对免疫功能起重要的调节作用。腹腔巨噬细胞(peritoneal elicited macrophages, PEMФ)常作为巨噬细胞研究的代表,用于其功能的探讨。我们既往研究证明,GPS能促进PEMФ的功能活动。但关于多糖激活PEMФ的机制,目前尚未完全清楚。本研究采用现代生物学技术,较为系统的探讨了GPS对PEMФ活性的影响及其与白血病细胞增殖抑制及凋亡的关系,旨在阐述人参“扶正祛邪”与抗肿瘤的相互关系与生物学机制,为临床开发治疗白血病的天然抗肿瘤药物提供实验依据。方法:1.小鼠PEMФ的分离纯化与鉴定:体外分离小鼠PEMФ,在含10%FBS的培养液中进行体外贴壁培养。倒置显微镜下观察细胞生长状态;酸性磷酸酶及非特异性酷酶染色检测,光镜观察细胞内酶的表达;吞噬鸡红细胞及墨汁颗粒实验检测其吞噬功能;CD68免疫细胞化学染色观察细胞表面标志,通过这些生物学技术鉴定培养细胞的性质。2. GPS对PEMФ功能的影响:将分离纯化的PEMФ与不同浓度的GPS进行共培养,检测其相关酶活性、吞噬功能及表面抗原的表达。3.经GPS诱导制备的PEMФ培养上清对白血病细胞凋亡的影响:将PEMФ与GPS共培养所获得的条件培养液,加入到K562、HL-60、KG1a白血病细胞培养体系中,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,观察经GPS诱导制备的PEMФ培养上清对白血病细胞增殖的影响。通过透射电镜观察、流式细胞术(FCM),研究经GPS诱导制备的PEMФ培养上清对白血病细胞凋亡的影响。4. GPS对PEMФ分泌生物活性因子及其与抑制白血病细胞增殖、凋亡之间的关系:采用Griess法、ELISA法,以及小鼠胸腺细胞增殖法分别测定条件培养液中一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-a)、IL-6、IL-12和IL-1的浓度,研究GPS对PEMФ生物学活性的影响及其与抑制白血病细胞增殖、凋亡之间的关系。结果:1.人参多糖对腹腔巨噬细胞活性的影响获得的PEMФ在生活状态下呈椭圆形、三角形或不规则形,胞浆丰富;HE染色后可见细胞有丰富的胞浆,胞浆内富含颗粒及少许空泡,核为圆形或卵圆形;细胞酶化学染色见酸性磷酸酶、非特异性酯酶均为阳性。吞噬功能检测细胞能吞噬鸡红细胞和墨汁颗粒,且吞噬率较高。免疫细胞化学染色CD68表达为阳性。研究经过形态学,酶化学,吞噬功能检测及免疫细胞化学证实所培养的细胞是纯化的,功能良好的PEMФ。与GPS共培养后,PEMФ的酸性磷酸酶及非特异性酯酶的合成与分泌增加,吞噬鸡红细胞与墨汁颗粒的功能增强,CD68的阳性表达率及表达强度提高,不同浓度的GPS对PEMФ的促进作用有一定的差别,以GPS终浓度为100mg/L时的促进作用最为明显。2.经GPS诱导制备的PEMФ培养上清对白血病细胞凋亡的影响MTT法显示,经GPS(25~200mg/L)诱导制备PEMФ对K562、HL-60、KG1a的增殖均有抑制作用,于100mg/L时,抑制率达到最高。透射电镜观察发现,K562、HL-60、KG1a 3种白血病细胞均发现有染色质浓缩、核的碎裂和凋亡小体等典型的凋亡特征出现,经流式细胞术检测表明,经GPS诱导制备的PEMФ培养上清对3种白血病细胞均有促进凋亡的作用。与阴性对照组相比,经GPS(25~200mg/L)诱导制备的PEMФ培养上清对白血病细胞的凋亡均有增强作用。3. GPS诱导的PEMФ培养上清液促进白血病细胞凋亡的生物活性因子分析在PEMФ与GPS共培养的条件培养液中,NO、TNF-a、IL-6和IL-1的分泌均有所增加,而IL-12的含量并未见明显增加。结论:人参多糖能够激活腹腔巨噬细胞,显著增强其功能,可能通过促进PEMФ分泌NO、TNF-a、IL-6和IL-1等效应分子,抑制白血病细胞的增殖,促进其凋亡,这也许是人参“扶正祛邪”的细胞与分子生物学机理之一。