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奶牛乳腺炎对奶牛健康造成了严重的危害,这使得治疗乳腺炎的成本不断增加。乳腺炎症是乳腺抵御外来刺激因素的免疫反应,适当的乳腺发炎对保持乳腺健康和功能的完整性具有重要意义。但当某些刺激持续作用于奶牛乳腺时,则可能引起长期的慢性炎症,造成免疫系统持续和不受控的激活,这种慢性炎症会造成奶牛个体利用率降低以及产品品质下降。核因子κB即NF-κB是一条经典的调控炎症的信号通路,其中p65亚基及调节因子对于乳腺炎的发生具有重要的调控作用。当刺激信号如细菌脂多糖LPS通过TLR4受体传入细胞内之后,经过一系列信号传递,IKK蛋白被激活进而使得IκB被磷酸化和泛素化并降解,释放出p65亚基;p65亚基发生磷酸化、乙酰化,并进入细胞核启动炎症因子,趋化因子,促炎因子的转录过程,因此IKK,IκB和p65是NF-κB信号通路的关键调控靶标,调控NF-κB及其调节蛋白对炎症预防与治疗具有重要指导意义。此外,MAPK信号通路能通过调节iNOS、COX-2等的表达参与炎症反应中的氧化应激。MAPK信号包含三个MAP激酶,即ERK1/2、JNK1/2和p38,它们存在于所有的真核细胞中。这些激酶被磷酸化后会激活iNOS、COX-2等及相关炎症因子,对ERK1/2、JNK1/2和p38磷酸化的调节可以影响炎症反应与氧化应激过程。本研究采用牛乳腺上皮细胞系MAC-T,通过MTT实验检测不同浓度芹菜素对MAC-T细胞的毒性作用,确定芹菜素作用的最佳浓度;通过不同浓度LPS进行不同时间处理筛选LPS最适的处理浓度和时间;在LPS和芹菜素不同浓度组合处理下,荧光定量检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和炎性介导因子COX-2和iNOS的相对表达量,揭示芹菜素对LPS诱导的MAC-T细胞炎症的抑制作用;通过WB检测p65、IκBα、ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平和免疫荧光检测IκBα的相对荧光强度以及p65的核转移变化,进一步揭示芹菜素抑制LPS诱导的MAC-T细胞炎性反应的分子通路。主要结果如下:1.LPS是一种革兰氏阴性菌细胞壁成分,能够触发炎症反应,是一种常见的炎症造模物质。通过荧光定量检测发现,不同浓度LPS(0、1、5、10、20μg/mL)和不同时间(1、12、24 h)处理后,IL-6和IL-1β的相对表达量随LPS浓度和处理时间的增加而增加;2.MTT检测发现,芹菜素的细胞毒性随其处理浓度(1、3、5、7、10、15、20、50、100μg/mL)增加而增加,当浓度达到20μg/mL时出现显著抑制细胞生长。3.不同浓度芹菜素对LPS(1μg/m L)诱导的MAC-T细胞处理24 h后结果显示,与对照组相比,芹菜素(1、7、15μg/mL)显著降低了COX-2、iNOS、IL-1β、IL-6的mRNA表达(p<0.01);4.蛋白质印迹和免疫荧光结果表明芹菜素(1、7、15μg/mL)显著降低了MACT细胞炎症反应中p65和IκBα的磷酸化水平(p<0.05),并且抑制了p65的核转移。另外,在MAC-T细胞炎症反应中,p38、JNK1/2和ERK1/2的磷酸化水平在芹菜素处理后也显著降低(p<0.01)。结论:1.芹菜素在<20μg/mL条件下,具有较低的细胞毒性;2.LPS能在较低浓度(1μg/m L)下处理1 h就能引起MAC-T细胞中炎症因子IL-6的极显著上调;3.芹菜素通过下调MAC-T炎症细胞中COX-2、iNOS、IL-1β、IL-6的表达量发挥抗炎作用;4.芹菜素的抗炎和抗氧化活性是通过抑制NF-κB和MAPK信号通路。这些结果提示,芹菜素可用于预防和治疗奶牛乳腺炎。