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【研究背景】面神经受损后因骨性面神经管所压迫，形成“水肿—缺血—水肿”的恶性循环，从而加重面神经的损伤，因此如何预防或减轻面神经缺血水肿，成为面瘫临床治疗中的关键。水通道蛋白（AQPs）是存在于细胞膜上，介导不同类型细胞跨膜水转运的膜蛋白家族，与组织器官水肿密切相关，其中AQP1是周围神经系统表达最多的水通道蛋白。我们前期工作证实了面神经组织内存在AQP1的表达，并在小鼠面神经离断伤模型中发现，面神经损伤后AQP1表达增高，与面神经损伤后水肿呈正相关，并进一步研究发现AQP1定位在雪旺细胞上。但是AQP1表达增高与面神经水肿的因果关系还未确定，即AQP1的高表达导致或加剧面神经水肿？还是面神经水肿伴随AQP1的高表达尚无定论；且AQP1在雪旺细胞内如何发挥生理和病理作用也不清楚。因此，本课题应用RNA干扰和过表达技术分别下调和上调雪旺细胞AQP1表达，研究AQP1表达变化在生理状态下对雪旺细胞形态和水转运的影响；并制作雪旺细胞CoCl2缺氧模型，模拟体内面神经损伤，研究在缺氧病理状态下AQP1的表达变化及其对雪旺细胞形态和水转运的影响，以确定AQP1表达与雪旺细胞肿胀的因果关系，并探讨雪旺细胞缺氧损伤后诱导AQP1表达增加的可能分子机制，为临床预防或减轻面神经水肿后的继发损伤提供理论依据。【目的】1、探讨AQP1基因表达和雪旺细胞肿胀之间的因果关系；2、明确AQP1在面神经损伤后水肿中的基因功能，为临床预防或治疗面神经水肿提供新思路；3、研究雪旺细胞在缺氧病理状态下缺氧诱导因子（HIF-1α）对AQP1表达的影响，探讨雪旺细胞缺氧损伤后诱导AQP1表达增加的分子机制。【方法】1、应用细胞免疫荧光技术验证小鼠面神经来源的原代雪旺细胞AQP1表达（1）采用酶消化法原代培养C57BL/6小鼠面神经雪旺细胞，差速贴壁法提纯；（2）免疫荧光共标染色鉴定所培养细胞AQP1和S-100表达。2、慢病毒介导的AQP1-shRNA对小鼠雪旺细胞形态及水转运的影响（1）小鼠AQP1-shRNA慢病毒载体构建与鉴定：对小鼠AQP1mRNA分析，设计合成的单链引物经退火形成双链oligo序列，连接入经Age I和EcoR I双酶切线性化的pLKO.1-TRC慢病毒质粒载体中，菌液PCR鉴定并经测序验证。测序正确后与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞，收集病毒上清经高速离心浓缩后感染小鼠雪旺细胞，RT-PCR和Western blot法分析筛选有效shRNA序列；（2）AQP1-shRNA感染雪旺细胞后，与CTRL组（scr-shRNA）比较，每天在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，连续6天；（3）细胞容积测定量化AQP1-shRNA细胞与CTRL(scr-shRNA)细胞水含量变化；（4）MTT法检测细胞增殖；（5）流式细胞术检测AQP1-shRNA对雪旺细胞凋亡的影响。3、慢病毒介导的AQP1过表达对小鼠雪旺细胞形态及水转运的影响（1）小鼠AQP1基因慢病毒载体构建与鉴定：将小鼠AQP1基因克隆到慢病毒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体，通过PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆。将鉴定后的重组表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-AQP1与包装质粒psPAX2、pMD共转染293T细胞，制备携带AQP1基因的慢病毒Lenti-AQP1，感染雪旺细胞，RT-PCR和Western blot检测感染后雪旺细胞AQP1mRNA和蛋白表达情况；（2）Lenti-AQP1感染雪旺细胞后，与CTRL组（empty vector）比较，每天在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，连续6天；（3）细胞容积测定量化Lenti-AQP1细胞与CTRL细胞水含量变化。4、缺氧状态下AQP1对小鼠雪旺细胞形态及水转运的影响（1）制作雪旺细胞CoCl2缺氧模型，模拟体内面神经损伤，RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色鉴定AQP1表达变化；（2）AQP1-shRNA处理后雪旺细胞，在缺氧状态下与CTRL组比较，观察缺氧后细胞形态变化情况，细胞容积测定鉴定细胞水含量变化。5、缺氧诱导AQP1表达增加的机制研究（1）雪旺细胞缺氧后RT-PCR、Western blot鉴定HIF-1α表达；（2）应用瞬时转染抑制HIF-1α表达，研究HIF-1αsiRNA对AQP1蛋白表达的影响。【结果】1、小鼠原代面神经雪旺细胞表达AQP1；2、成功退火合成3对发夹shRNA序列并将其克隆到pLKO.1-TRC载体中，构建重组质粒pLKO-AQP1-SH1、2、3，经菌液PCR鉴定和测序验证载体构建成功。Realtime-PCR检测发现重组质粒pLKO-AQP1-SH2感染雪旺细胞后AQP1mRNA表达最低，Western blot结果进一步验证结果的准确性；AQP1shRNA能使雪旺细胞形态皱缩，细胞水含量明显降低（P<0.001）；AQP1-shRNA细胞较CTRL组细胞增殖活力降低（P<0.05），但不会引起雪旺细胞明显的凋亡。3、构建的慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-AQP1经PCR鉴定和测序正确，慢病毒Lenti-AQP1感染雪旺细胞后AQP1mRNA和蛋白表达明显增加；AQP1过表达使雪旺细胞肿胀，细胞形态近似圆形，细胞水含量显著增加（P<0.001）；4、雪旺细胞缺氧后AQP1mRNA和蛋白表达水平增加，免疫荧光染色发现AQP1强烈表达在雪旺细胞膜上，细胞形态近似椭圆形；慢病毒稳定转染AQP1-sh细胞较scr-sh细胞缺氧后细胞肿胀不明显（P<0.001)；5、雪旺细胞缺氧后HIF-1αmRNA和蛋白表达水平增加，HIF-1αsiRNA降低了体外缺氧诱导AQP1蛋白表达水平。【结论】1、AQP1是控制雪旺细胞快速水转运的主要因素；2、AQP1是参与雪旺细胞可塑性的一种蛋白；3、AQP1表达变化是缺血、缺氧诱导面神经水肿的主要因素；4、HIF-1α参与缺氧诱导AQP1表达增高；5、抑制AQP1表达水平可能提供一种临床治疗面神经水肿的新方法。