第一部分胶质瘤干祖细胞分化抑制的超微结构机制【目的】在先前的研究中已经见到,体外培养的胶质瘤干祖细胞(glioma stem progenitor cells, GSPCs)与神经干祖细胞(neural stem/progenitor cells, NSPCs)相比的最大不同点是GSPCs始终处于分化抑制状态,还时有逆向分化发生,为了寻找产生这种区别的原因,本实验比较两者超微结构的异同,旨在亚细胞水平阐明GSPCs分化抑制的机制。【方法】GSPCs由我们实验室保存。NSPCs来源于流产的人胚脑,经分离、培养、扩增后,予以鉴定。分别收集GSPCs和NSPCs,培养于经多聚赖氨酸预处理的无菌玻片上,2小时后结束培养,取贴敷有细胞的玻片行扫描电镜检查。同时,收集GSPCs和NSPCs行透射电镜观察,定性或定量比较二者单细胞的细胞膜、细胞器、细胞核以及核内容物的异同,分析细胞球间结构的异同。【结果】GSPCs和NSPCs共同点如下:细胞器不发达,少数细胞中可见神经微丝、微管,核质比高,核内常染色质多,异染色质少。二者形成的细胞球内的细胞间均存在特定的细胞连接。不同点有:GSPCs的细胞体积比NSPCs大;GSPCs的微绒毛丰富;GSPCs中核糖体、内质网、高尔基体等与蛋白质合成分泌相关的细胞器较NSPCs发达,GSPCs中线粒体数量较NSPCs多;部分NSPCs中自噬小体多见,而GSPCs罕见自噬小体;GSPCs胞核体积较NSPCs大,但核质比NSPCs小,GSPCs核内异染色质的相对含量比NSPCs多,GSPCs多有两个或以上核仁。NSPCs球的相邻细胞间可见突触样连接、胞膜融合等结构,GSPCs球内相邻细胞间仅可见桥粒样结构。需要特别指出的是GSPCs比NSPCs的自噬小体数量明显少。【结论】GSPC和NSPC在超微结构上的异同点,是我们先前见到的GSPCs始终处于分化抑制状态的亚细胞形态结构基础,也有可能是GSPCs产生逆向分化的原因,对进一步研究GSPCs与NSPCs相比之所以具有独特的的肿瘤生物学特征有重要意义,特别是自噬小体数量的变化值得进一步研究。第二部分胶质瘤干祖细胞分化抑制与其自噬活性低下相关【目的】在第一部分研究中观察到了GSPCs中自噬小体的数量明显少于NSPCs,本研究观察其是否存在自噬活性的变化,以及这种变化与GSPCs分化抑制的关系。【方法】利用第一部分中培养所得的GSPCs和NSPCs,分别用单丹(磺)酰戊二胺MDC染色、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain-3,LC3, LC3)免疫荧光染色、western-blot法检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ等多种方法检测GSPCs与NSPCs中自噬活性的差异。检测GSPCs分化后的自噬活性,在诱导GSPCs分化同时加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(methyladenine,3-MA)或Bafilomycin A1(BFA),观察抑制自噬是否可以抑制GSPCs的分化。自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin,RPM)被用于检测是否能促进GSPCs的分化。【结果】自噬在GSPCs中的活性明显低于其在NSPCs中的活性。当诱导GSPCs分化后,其自噬活性增高;自噬的抑制剂3-MA或BFA作用于GSPCs可以抑制后者贴壁分化,western blot分析提示经上述自噬抑制剂作用后的GSPCs的GFAP以及MAP-2的表达量较未加抑制剂的对照组降低。自噬的活化剂RPM在适当的条件下可以促进GSPCs的贴壁分化。【结论】通过自噬抑制剂或活化剂从正反两方面证实GSPCs的自噬活性与其分化抑制相关,为进一步探索发生这种变化的分子机制打下了基础。第三部分胶质瘤干祖细胞自噬活性低下与PTEN基因失活相关【目的】PTEN是一种与自噬密切相关又常常在神经系统肿瘤中失活的抑癌基因,通过第二部分研究明确了GSPCs分化抑制与其自噬活性低下有关。本部分的研究欲探讨是否GSPCs的自噬活性低下与PTEN基因失活相关。【方法】对比GSPCs和NSPCs中PTEN基因序列与genbank中报道的序列的异同,以及翻译后蛋白质多肽链中氨基酸残基序列的差异。通过腺病毒介导将外源的野生型PTEN转导入GSPCs,检测自噬活性的变化。【结果】与genbank报道的序列相比较,GSPCs中PTEN存在多数碱基的点突变,而NSPCs中PTEN基因则完全与genbank中报道的序列相吻合;翻译成为多肽链后,可见GSPCs的PTEN蛋白质在N端存在连续多个氨基酸残基(第8-14个氨基酸)变异,同时,第238和398两个位点上的氨基酸也发生突变。转导野生型的PTEN后,GSPCs的自噬活性显著增强。【结论】GSPCs内PTEN基因失活是其自噬活性低下的原因之一,对进一步研究与自噬性相关的靶分子具有重要价值。第四部分胶质瘤干祖细胞分化抑制后向血管内皮细胞转分化研究【目的】GSPCs分化抑制是胶质瘤的一种恶性表现。在第一至第三部分研究中,已从细胞、亚细胞和分子水平上证明了GSPCs的分化抑制与其自噬活性低下、PTEN基因失活相关;同时,胶质瘤内丰富的血供、活跃的血管形成也同样是胶质瘤恶性表现,但是否与GSPCs相关尚不清楚。所以,在第四部分我们旨在研究GSPCs是否可以通过向血管内皮细胞转分化进而参与胶质瘤的血管形成。【方法】将GSPCs培养于转分化培养基内(含多种生长因子),并以培养在普通条件下(仅含10%小牛血清)的GSPCs作为对照,10天后观察细胞的形态学变化。将GSPCs培养于Matrigel上,动态观察GSPCs的形态、结构的变化,10天后终止培养,免疫组织化学法检测CD31的表达;并取少许含有细胞的Matrigel行透射电镜检测,观察胶中细胞的超微形态学特征。同时,将GSPCs培养于缺氧或缺氧合并缺糖的条件下4小时,然后通过RT-PCR法、实时定量PCR以及免疫细胞化学荧光染色法检测CD31,CD34,KDR和vWF等血管内皮细胞标志物在转录以及翻译水平的变化。【结果】培养于分化培养基内的GSPCs在10天后呈典型的“铺路石”样的表型,而对照组则仅贴壁分化呈星形或梭形细胞;培养在Matrigel上的GSPCs随着时间的延长呈现一系列的变化,从单细胞逐渐变成管状结构;后者为CD31阳性,在透射电镜下呈中空的管腔,管腔周围的细胞具有血管内皮细胞样的超微结构特点。当GSPCs培养于缺氧或缺氧合并缺糖的条件下时,其多种血管内皮细胞的标志分子在转录和翻译水平显著上调。【结论】GSPCs在摸拟体内常见的缺血后引起缺氧条件下培养,可以向血管内皮细胞方向发生转分化。为进一步在动物体内原位接种GSPCs研究胶质瘤细胞自主产生新生血管找到了依据,对阐明肿瘤血管发生机理研究具有重要意义。