高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选鉴定、条件优化及谷氨酸脱羧酶基因的克隆

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γ-氨基丁酸(GABA)是一种广泛分布于动物、植物和微生物体内,是一种天然存在的非蛋白质氨基酸。在动物体内,γ-氨基丁酸主要作为一种抑制性神经递质存在,参与脑循环生理活动,具有降低血压、促进生长、治疗癫病、抗衰老、促进采食行为、预防肥胖、促进生殖、肝功能活化等多种生理功能,在食品和药品工业中被广泛使用。谷氨酸脱羧酶(GAD)是催化L-谷氨酸的α位脱羧生成γ-氨基丁酸的限速酶,是调控GABA产量的关键基因。本研究从酸菜中分离筛选到1株高产γ-氨基丁酸乳酸菌菌株Lb-2,通过乳酸菌的形态特征、生理生化特征和16 S rDNA基因序列分析对菌株Lb-2进行鉴定,再通过对培养基和发酵条件的优化,提高GABA产量。利用PCR扩增技术克隆得到乳酸菌Lb-2全长gad,对该基因进行了序列、同源性及功能分析。首先,从酸菜和酸奶中分离筛选出产γ-氨基丁酸(GABA)乳酸菌21株,采用改良纸层析结合高效液相色谱测定获得1株高产乳酸菌菌株Lb-2,该Lb-2菌株在含10 g/L谷氨酸钠的MRS培养基中静置培养48 h,发酵液中GABA含量可达9.24 g/L。根据乳酸菌的形态特征、生理生化特征和16 S rDNA基因序列分析鉴定Lb-2菌株为乳杆菌属(Lactobacillus)的短乳杆菌(Lactobacillus brevis),并与基因库中的序列进行同源性分析。其次,通过对培养基组成和培养条件进行单因素实验,如培养基碳源、氮源,初始pH值、培养温度和培养时间等筛选影响GABA产量的主要因素。在单因素实验的基础上,以初始pH(5.0、5.5、6.0)、培养温度(30℃、32℃、34℃)、和培养时间(48 h、60 h、72 h)为三因素及其水平,GABA产量为指标,对发酵条件进行L9(33)正交试验,通过正交实验对发酵条件进行整体优化。最佳组合为培养初始pH5.5、培养温度32℃、培养时间为72 h,优化发酵条件下GABA的产量提高到13.45g/L最后,以短乳杆菌Lb-2菌株为gad的来源,根据短乳杆菌gad序列两端区域设计一对特定引物,利用PCR技术扩增获得gad基因,并与pUC18-T Simple Vector连接,经测序后,结果表明乳酸菌Lb-2 gad长度为1288 bp,并将该基因命名为Lbgad。该基因与GenBank数据库内短乳杆菌(Lactobacillus brevis) gad序列的大小完全一致,两者核苷酸序列的相似性为96%,Lbgad氨基酸序列与其他微生物谷氨酸脱羧酶存在一定的同源性。
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