论文部分内容阅读
副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）,可以引起仔猪严重的全身性炎症反应,导致大量仔猪的发病和死亡,给全球生猪养殖业带来重大的经济损失。由HPS感染所引起的格拉泽氏病（Gl（?）sser’s disease）的特征性症状为全身性的急性渗出性纤维素炎。目前,尚未有研究报道HPS引起渗出性纤维素炎的具体分子机制。本研究分析了HPS诱导猪肺泡巨噬细胞3D4/21中抵抗素（Resistin）表达和分泌的机制,以及Resistin对原代猪血管内皮细胞（Porcine vascular endothelial cell,PVEC）间紧密连接结构的调控,以探究HPS破坏内皮细胞结构、引起渗出性炎症发生的机制;本研究同时探索了HPS引起新生猪气管上皮细胞NPTr和猪肾上皮细胞PK-15中上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）效应的发生和调控机制,解析HPS破坏上皮细胞结构,引起全身性感染的病理机制。具体内容如下:1.HPS诱导3D4/21细胞分泌的Resistin破坏内皮细胞PVEC间紧密连接结构本研究发现HPS可以诱导3D4/21细胞表达和分泌Resistin,且Resistin的表达和分泌受到转录因子Ets2的调控。进一步检测发现,HPS感染3D4/21细胞后激活p38 MAPK通路,该通路通过调控Ets2基因的表达,介导Resistin的表达和分泌。通过跨内皮电阻测定实验发现,3D4/21细胞缺失Resistin后,明显抑制HPS引起的体外共培养体系中PVEC通透性的升高,这表明HPS感染时,3D4/21细胞分泌的Resistin增加了PVEC通透性。进一步研究发现,Resistin通过LKB1/AMPK/mTOR通路抑制PVEC中紧密连接结构蛋白Claudin-5和Occludin的表达,从而增加PVEC的通透性。2.HPS中外膜脂蛋白LPPA参与调控Resistin的分泌和PVEC间紧密连接结构的破坏通过跨内皮电阻测定实验发现,HPS强毒株与弱毒株感染3D4/21细胞后,Resistin的表达水平和体外共培养体系中PVEC的通透性均存在显著差异。通过比较强弱毒株间的基因分布差异,筛选出32个显著分布于HPS强毒株中的基因,分别针对这些基因构建单基因缺失株,发现HPS强毒株在缺失细菌外膜脂蛋白基因lppA时,可以显著回复3D4/21细胞中Resistin的表达水平,以及PVEC中Claudin-5和Occludin的表达水平。通过基因缺失突变株ΔlppA及其互补菌株C-lppA与野生型HPS-SH0165的比较发现,HPS的外膜脂蛋白LPPA通过p38 MAPK/Ets2通路调控了3D4/21细胞中Resistin表达和分泌。同时,HPS的外膜脂蛋白LPPA通过改变LKB1/AMPK/mTOR通路的活性,调控PVEC中Claudin-5和Occludin的表达以及PVEC的通透性。3.HPS通过p38 MAPK通路调控Wnt/β-catenin通路介导的上皮细胞EMT效应本研究从细胞形态和分子水平证明了HPS促使PK-15和NPTr细胞发生EMT效应。而在抑制Wnt/β-catenin通路激活或干扰通路下游靶基因MMP7、COX2和PAI-1的表达后,PK-15和NPTr细胞中HPS诱发的EMT效应减弱。这表明Wnt/β-catenin通路通过调控下游靶基因的表达,启动了上皮细胞的EMT效应。通过进一步的通路抑制实验发现,在抑制p38 MAPK通路活性后,可以抑制PK-15和NPTr细胞中HPS对Wnt/β-catenin通路的激活。而在PK-15和NPTr细胞缺失Wnt/β-catenin通路天然抑制子DKK1基因时,p38 MAPK失去了对Wnt/β-catenin通路的调控作用。这表明在PK-15和NPTr细胞中,HPS通过p38 MAPK/DKK1通路调节Wnt/β-catenin通路的活性。相应的,在HPS感染的PK-15和NPTr细胞中,抑制p38 MAPK通路活性后,Wnt/β-catenin通路所介导的EMT效应也明显减弱。表明p38 MAPK通路参与调控HPS感染时Wnt/β-catenin通路介导的EMT效应。本研究首次证明HPS通过诱导猪肺泡巨噬细胞分泌的Resistin,破坏内皮细胞中的紧密连接结构,增加内皮细胞通透性。同时通过p38 MAPK和Wnt/β-catenin通路促使上皮细胞发生EMT效应,增加上皮细胞移动性。HPS对内皮细胞的损伤可能促进了渗出性炎症的发生,而对上皮细胞的破坏可能有助于HPS在动物机体内的扩散。综上,本研究为解析HPS感染引起渗出性纤维素炎的致病机理提供了初步的理论基础。