茶树是重要的非酒精饮料之一,富含的苯丙烷类化合物是其主要的功能成分。有关茶树体内苯丙烷类化合物合成调控机理的相关研究报道较少。第四亚组R2R3MYB转录因子是植物一类能够抑制苯丙烷以及木质素途径的转录抑制因子。苯丙烷途径的结构基因如C4H和4-香豆酸:辅酶A连接酶基因(4CL)是它们调控的靶基因。此外第四亚组R2R3MYB同样可以调控植物的黄酮类化合物代谢。本论文分离鉴定了一个茶树第四亚组R2R3MYB转录因子CsMYB4a和两个4CL基因,并验证了它们的功能。本论文研究内容对研究茶树苯丙烷类化合物代谢的调控以及苯丙烷代谢流向黄酮以及木质素的途径的流路分析有着重要的意义。主要研究结果如下:(1)本论文分离了一个茶树R2R3MYB转录因子,氨基酸序列比对以及系统发育树分析结果表明,它属于R2R3MYB第四亚组,并被命名为CsMYB4a,CsMYB4a在茶树中的表达模式同茶树中的酚酸以及儿茶素含量呈现负相关。(2)构建了CsMYB4a-PCB2004表达载体,利用农杆菌侵染技术,在模式植物烟草中过表达CsMYB4a基因,形态学观察结果表明,转基因烟草的整体生长发育受到抑制,叶片出现皱缩、发脆和黄化坏死的症状。这些症状类似于前人研究报道。(3)利用转录组测序、qRT-PCR等技术检测基因表达差异,结果表明在过表达CsMYB4a烟草中,参与木质素合成的苯丙烷类化合物代谢途径的结构基因表达明显下调,同时还发现几乎整个莽草酸代谢途径的基因表达也明显受到抑制。利用相关代谢组学技术检测相关化合物含量变化,发现过表达CsMYB4a烟草中相关代谢代谢产物如L-苯丙氨酸、木质素、绿原酸以及芦丁等含量也相应降低。除了上述莽草酸和苯丙烷等次生代谢途径,实验还发现CsMYB4a同样对植物的初级代谢途径包括糖酵解、三羧酸(TCA)、磷酸戊糖途径(PPP)以及淀粉和蔗糖代谢产生影响(上调或者下调)。相关代谢组学技术检测结果发现相对于野生型烟草,CsMYB4a转基因烟草中积累了较多的糖、苹果酸以及较少的柠檬酸化合物。(4)为了进一步验证CsMYB4a的作用机理,本文首先通过凝胶阻滞电泳实验验证了CsMYB4a蛋白可以与四种AC元件结合;分析了烟草初级代谢以及次级代谢途径中45个差异表达基因的启动子区域,以及茶树苯丙烷和类黄酮途径中5个重要结构基因的启动子区域的AC元件分布规律;最后,利用双荧光素酶转录抑制实验验证了CsMYB4a可以抑制莽草酸、苯丙烷和类黄酮途径中关键结构基因包括NtGAPN,NtAROF,NtAROA,CsC4H,Cs4CL,CsCHS,CsLAR以及CsANR的启动子的活性。(5)过表达CsMYB4a的转基因拟南芥中同样表现出植株矮小的症状,Q-RTPCR分析结果表明拟南芥中过表达CsMYB4a抑制了莽草酸、苯丙烷和木质素途径上一些关键基因的表达水平。(6)本论文克隆了两个茶树4CL基因(Cs4CL1,Cs4CL2),氨基酸比对分析结果发现Cs4CL1和Cs4CL2都具有4CL家族保守域BOX-I以及BOX-II;系统发育树分析表明Cs4CL1位于CLASSI组(木质素合成相关),Cs4CL2位于CLASSII组(黄酮合成相关)。Cs4CL1在老叶以及茎根中高表达而Cs4CL2在芽以及嫩叶中高表达。(7)构建Cs4CLs-PRSF载体,将Cs4CL1和Cs4CL2导入大肠杆菌中表达并纯化得到重组蛋白。Cs4CL1以及Cs4CL2重组蛋白都可以催化底物咖啡酸、对香豆酸以及阿魏酸形成相应的辅酶A酯。酶动力学分析证明Cs4CL1重组蛋白的最适底物是咖啡酸而Cs4CL2重组蛋白对于三种底物的活性都比较高。(8)亚细胞定位实验证明了Cs4CL1以及Cs4CL2蛋白都定位在细胞质内质网上。在烟草中异源表达Cs4CL1以及Cs4CL2并未引起转基因植株性状上的变化,但使转基因植物中积累了更多的木质素以及黄酮类化合物。这些实验证明了茶树中Cs4CL1以及Cs4CL2基因的功能,其中Cs4CL1可能与木质素的合成更相关,Cs4CL2可能与黄酮类化合物的合成更相关。(9)本文通过染色体步移法克隆了茶树中Cs4CL1以及Cs4CL2的启动子序列,通过对于启动子区域上顺式作用元件的分析发现Cs4CL1与Cs4CL2都具有较多的光反应元件,Cs4CL1启动子含有更多的胁迫反应元件以及特异性的组织元件,Cs4CL2具有更多的MYB转录因子结合的AC元件。