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作为一种高档食材的鹅肥肝是重要的水禽产品,由短期的人工填饲而成,重量可达到正常肝重的8-10倍而不产生明显的病理变化,含有大量的脂肪。然而,不同于哺乳动物的非酒精性脂肪肝,鹅肥肝几乎不出现任何明显的病理性变化,如炎症、纤维化等,这提示鹅肥肝存在着某种独特的耐受机制。揭示这种耐受机制可能为提高鹅肥肝的产量和其他畜禽脂肪肝的研究提供有益的参考。泛素化是蛋白质降解的主要途径,参与多种细胞生物学过程,包括细胞生长与增殖、存活与死亡以及免疫炎症反应等。本研究通过转录组测序分析筛查朗德鹅正常肝与肥肝间的差异表达基因,发现其中有66个差异表达基因与泛素化/去泛素化相关。特别地,神经前体细胞表达发育下调基因4(neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated 4,NEDD4)在填饲 77、84 和 89 天鹅肝脏中的 mRNA表达量均显著高于正常肝脏。NEDD4是一种E3泛素化连接酶,可以通过多个靶蛋白如PTEN和IGF1R等在肝脏再生和脂代谢中发挥重要作用。然而,NEDD4是否通过这些靶蛋白参与鹅肥肝的形成,目前尚无报道。为阐明这一问题,本研究进一步采用荧光定量PCR和免疫印迹技术测定鹅肥肝和正常肝中NEDD4的mRNA和蛋白质表达量,利用免疫共沉淀和免疫印迹技术检测NEDD4与靶蛋白间的物理性关联,以及通过NEDD4过表达验证鹅肝细胞中NEDD4促进靶蛋白降解的作用,从而为深入研究NEDD4在鹅肥肝形成中的作用奠定基础。主要研究结果如下:1.通过鹅肥肝的转录组测序分析发现在77、84和89天三个时间点各有458、875和1733个差异基因,其中与泛素化及去泛素化相关的基因共66个。特别地,与对照组相比,填饲组鹅肝脏中NEDD4基因的mRNA表达水平在三个时间点均显著增加(P<0.05)。2.NEDD4及其潜在靶基因PTEN和IGF1R参与鹅肥肝的形成。在填饲24天时鹅肥肝中NEDD4的mRNA和蛋白质表达量均显著高于正常肝中的表达量(P<0.05),提示填饲对NEDD4表达量的诱导主要是在转录水平上。对于鹅肥肝形成过程中NEDD4的潜在靶基因PTEN和IGF1R,荧光定量PCR和免疫印迹分析表明,与对照组相比,鹅肥肝中PTEN和IGF1R的mRNA表达量显著增加(P<0.05),而PTEN的蛋白质表达量显著减少(P<0.05),IGF1R的蛋白质表达量呈减少趋势(P=0.07)。这些结果表明NEDD4及其靶蛋白PTEN和IGF1R均参与鹅肥肝的形成。3.鹅肝中NEDD4与PTEN蛋白质间存在物理性关联,且PTEN泛素化表达水平受到泛素化调控。为明确鹅肝中NEDD4和PTEN蛋白质间是否存在物理性关联,NEDD4抗体被用于鹅肝组织样的免疫共沉淀,并对所获沉淀物进行NEDD4和PTEN的免疫印迹分析。结果表明,在填饲24天的鹅肝脏组织中,NEDD4基因与PTEN基因存在着物理性关联。为明确鹅肥肝形成过程中PTEN是否受泛素化修饰,鹅肥肝与正常肝组织裂解液被用于PTEN的免疫沉淀,随后沉淀物被用于泛素的免疫印迹分析,免疫印迹时各样品的沉淀物上样量相同。结果显示鹅肝脏组织中PTEN的蛋白质水平受泛素化调控,且鹅肥肝中的泛素化水平明显高于对照组正常肝中的泛素化水平。4.NEDD4的过表达促进PTEN和IGF1R蛋白质水平的降解。在鹅原代肝细胞中过表达NEDD4并检测PTEN和IGF1R的mRNA和蛋白质的表达水平,以验证NEDD4与PTEN和IGF1R的靶向关系。结果显示,NEDD4的过表达,导致PTEN和IGF1R和蛋白质的表达量显著下调(P<0.05),但PTEN的mRNA不受显著影响。这些结果进一步证实了鹅肥肝形成中NEDD4可以促进PTEN和IGF1R的降解。综上所述,在鹅肥肝形成过程中,NEDD4的表达增加促进了 PTEN和IGF1R的泛素化与降解,并可能通过其靶蛋白保护鹅肥肝免受严重脂肪变性引起的损伤以及促进鹅肥肝的增长。