背景:生物标志物(biomarkers)的研究是预防医学核心研究内容之一,它是一种具有能够客观测量并评价一般生物过程、病理过程或对医疗干预相关药物反应的指示物,也是生物体受到损害后的重要预警指标,涉及到细胞分子结构和功能的改变,生理活动的异常变化,生化代谢过程的改变,个体、群体或整个生态系统的异常表现等。生物标志物的研究为有效地预防和控制健康危害提供了理论依据。近年来随着分子生物学及相关前沿生命学科的深入发展,生物标志物的研究已成为国内外预防医学界共同关注的热点,被称为是环境医学发展到分子水平的一个重要里程碑,其研究在分子流行病学、环境卫生学、劳动卫生学、分子毒理学等诸多领域的价值是十分重要的。在环境流行病学的研究中,肿瘤分子标志物的研究对于预测肿瘤风险、评估临床治疗效果、判断预后及指导三级预防等方面起了重要作用,因此被得到广泛应用。原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。据最新统计显示,近年来肝癌的发病率和死亡率呈上升趋势,在世界范围内其发病率和死亡率分别位居男性恶性肿瘤的第5位和第2位、女性恶性肿瘤的第7位和第6位。其中,我国肝癌的新发病例和死亡病例数约占全球的一半左右,其死亡率仅次于胃癌。根据我国2010年肿瘤登记数据统计显示,广西肝癌的发病率和死亡率分别为43.76/10万和35.82/10万,均分别高于全国的肝癌发病率(28.71/10万)和死亡率(26.04/10万),位于全部恶性肿瘤死亡的第一位。随着人口老龄化的加剧,肝癌的发病/死亡绝对数将会进一步上升,有研究表明,预计到2030年肝癌的发病/死亡人数将增加60%。原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)具有恶性程度高,治疗困难,发展速度快,生存时间短的特点,5年生存率不足10%。原发性肝细胞癌的临床病象极不典型,其症状一般多不明显,特别是在病程前期。目前,由于缺乏有效的早期诊断标志物,使得其只有30%~40%的肝癌患者可以获得及时诊断和有效治疗。因此迫切需要寻找一种特异度和敏感度均较高的肝癌标志物,以提高肝癌的早期诊断水平,保证患者的预后。肿瘤的发生与发展涉及到基因组、转录组、蛋白组和代谢组等多个不同层次的病理过程。单组学数据分析是传统肿瘤标志物的研究策略,往往只能体现出疾病样本其中一个层面的变化,在筛选肿瘤标志物方面具有局限性。通过对多层次多组学数据的交集分析,将有助于人们更加系统全面的认识肿瘤的生物学行为,进一步为寻找有价值的肿瘤标志物和探讨肿瘤相关机制提供新的线索。利用多种组学技术目前已成为肿瘤研究领域新兴的热点方向。本研究将多种组学研究策略运用于肝癌标志物的筛选和鉴定:(1)采用细胞转录组学结合组织转录组学分析策略,寻找肝癌细胞和组织中共有的差异表达基因;(2)采用血清蛋白组学结合细胞转录组学分析策略,筛选肝癌血清和细胞中共有的差异表达因子。然后通过生物信息学分析其生物学特性及功能,进一步利用q RT-PCR、免疫组化、Western blotting等技术验证差异因子在肝癌细胞、组织及血清中的表达水平,并结合临床病理资料分析及生存率分析,为肝癌的防治研究提供有价值的肿瘤分子标志物。第一部分转录组学测序筛选肝癌潜在标志物NEK2目的:利用转录组学测序技术筛选肝癌细胞与肝癌组织中共有的差异表达基因,并验证其在肝癌细胞和组织的表达水平,结合临床病理资料分析和通路相关因子的关联分析,探讨其作为标志物在肝癌发生发展中的可能作用机制。方法:1.采用Ion Proton转录组测序平台对肝癌细胞SMMC-7721和正常肝细胞L-02进行转录组双端测序,获得差异表达基因。2.将细胞转录组学与组织转录组学数据进行交集分析,得到共有的差异表达基因,并将差异表达最为明显的基因列为候选标志物。3.利用q RT-PCR验证候选标志物NEK2基因在肝癌细胞SMMC-7721和正常肝细胞L-02,以及5例肝癌和癌旁组织中的表达水平;免疫组化验证候选标志物NEK2蛋白在63例肝癌组织和癌旁组织中的表达水平。4.分析候选标志物NEK2的表达与63例肝癌样本临床病理特征之间的关系。5.对候选标志物可能涉及通路中的关键蛋白p-AKT和MMP-2进行关联性分析。结果:1.转录组测序结果显示,在肝癌细胞SMMC-7721与正常肝细胞L-02中共得到差异表达基因611个,其中肝癌细胞中上调368个,下调243个。2.将细胞转录组学和组织转录组学的差异表达基因进行交集分析,可以得到12个共有的差异表达基因,在肝癌中表达上调基因10个,表达下调基因2个,其中NEK2在细胞转录组学和组织转录组学中差异最为明显,因此将NEK2基因作为验证的候选标志物。3.验证结果表明,NEK2 m RNA在肝癌细胞SMMC-7721中的相对表达量为0.024±0.0026,是正常肝细胞L-02表达量0.014±0.0003的1.71倍(P=0.002);NEK2 m RNA在肝癌组织中的相对表达量为5.60±3.69,是癌旁组织表达量0.34±0.38的16.47倍(P=0.013);NEK2蛋白在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P=0.000)。4.肝癌临床病理特征分析发现,NEK2、p-AKT和MMP-2在肿瘤大小≤10 cm组的表达水平均分别是肿瘤大小>10 cm组的1.58倍(P=0.024)、2.24倍(P=0.041)和2.29倍(P=0.013),NEK2和MMP-2在包膜不完整组的表达水平分别是包膜完整组的1.91倍(P=0.000)和2.04倍(P=0.009),NEK2、p-AKT和MMP-2在多结节组中的表达水平分别是单结节组的1.62倍(P=0.012)、2.40倍(P=0.046)和2.04倍(P=0.024),NEK2和p-AKT在复发组中的表达水平分别是非复发组的2.09倍(P=0.004)和3.24倍(P=0.045)。5.关联性分析结果显示,肝癌组织中NEK2的表达与p-AKT和MMP-2均成显著正相关,相关系数分别为r=0.832(P<0.01)和r=0.763(P<0.01)。结论:NEK2很可能是具有重要功能的肝癌标志物,并且其表达与肝癌的侵袭转移有关,可能通过激活PI3K/AKT信号通路增加肿瘤细胞的侵袭转移能力。第二部分转录组结合蛋白组学筛选肝癌潜在标志物HSP90α目的:利用蛋白组学结合转录组学的策略筛选肝癌细胞与肝癌血清中共有的差异表达因子,验证其在肝癌细胞、血清和组织的表达水平,及其与临床病理特征之间的关系。方法:1.采用iTRAQ-LC-MALDI-TOF/TOF蛋白组学技术对10例人肝癌血清和10例正常对照组血清进行质谱分析,获得肝癌相关差异表达蛋白。2.将血清蛋白组学与细胞转录组学数据进行交集分析,得到共有的差异表达因子,并将差异表达最为明显的因子列为候选标志物。3.利用q RT-PCR验证候选标志物HSP90α在肝癌细胞SMMC-7721和正常肝细胞L-02中的表达水平;Western blotting、ELISA验证HSP90α在7例肝癌血清和7例正常对照血清中表达水平;免疫组化验证HSP90α蛋白在76例肝癌组织和癌旁组织中的表达水平。4.分析候选标志物HSP90α的表达与76例肝癌样本临床病理特征之间的关系。结果:1.蛋白组学结果显示,在人肝癌血清和正常对照组血清中共鉴定出31个差异表达蛋白,其中在肝癌血清中上调17个,下调14个。2.将血清蛋白组学与细胞转录组学的差异表达因子进行交集分析,可以得到3个共有的差异表达因子,在肝癌中表达上调2个,表达下调1个,其中HSP90α在血清蛋白组学与细胞转录组学中差异最为明显,因此将HSP90α基因作为验证的候选标志物。3.验证结果显示,HSP90αmRNA在肝癌细胞SMMC-7721中的表达水平是正常肝细胞L-02表达水平的4.18倍(P<0.05);Western blotting结果显示HSP90α蛋白在肝癌血清中的表达水平是正常对照组的7.26倍(P<0.05);ELISA结果显示HSP90α在肝癌血清中的表达量为273.6±20.3μg/ml,也明显高于在正常对照组血清的表达量186.2±18.3μg/ml(P<0.05);HSP90α蛋白在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。4.肝癌临床病理特征分析发现,HSP90α在肝癌转移组和非转移组中被判定为强阳性的比例分别为66.7%和25%,在肝癌转移组中的表达水平显著高于非转移组(P=0.010)。结论:HSP90α可能是重要的肝癌标志物,并且与肝癌的侵袭转移有密切的关系。第三部分NEK2和HSP90α诊断肝癌的价值及生存率分析目的:利用TCGA数据库中的肝癌患者数据,进一步评估NEK2和HSP90α在诊断肝癌的价值及生存率分析,探讨其临床应用的可行性。方法:1.下载TCGA数据库中肝癌的RNASeq V2数据,分别计算NEK2基因和HSP90α基因在359例肝癌及癌旁组织中的表达差异性。2.ROC曲线分析,获得NEK2和HSP90α对肝癌诊断的最佳临界点、AUC及诊断灵敏度与特异度。3.根据ROC曲线提供的诊断最佳临界点,将肝癌患者分为NEK2和HSP90α高表达组和低表达组,并利用Kaplan-Meier生存曲线分析NEK2和HSP90α高表达组和低表达组患者的生存率差异。结果:1.NEK2和HSP90α在肝癌组织中的表达均显著上调,其中NEK2在肝癌组织中的表达水平是癌旁组织的19.036倍(P<0.001),HSP90α是癌旁组织的1.399倍(P<0.001)。与HSP90α相比,NEK2在肝癌组织中表达上调的更为明显。2.NEK2和HSP90α对肝癌均有较好的诊断准确性,并且NEK2诊断准确性高于HSP90α,其AUC分别为0.960(P=0.003)和0.703(P=0.029);NEK2和HSP90α对肝癌诊断的最佳临界点分别为52.73和17971.78;NEK2诊断肝癌的灵敏度和特异度分别为0.98和0.82,HSP90α诊断肝癌的灵敏度和特异度分别为0.88和0.55,与HSP90α相比,NEK2诊断肝癌显示出更高的灵敏度和特异度。3.生存曲线分析结果显示,NEK2和HSP90α基因的表达情况均与患者生存率有关(P=0.0145和0.0032),并且高表达组患者生存率低于低表达组。结论:NEK2和HSP90α对肝癌均有较好的诊断价值,NEK2和HSP90α高表达的肝癌患者预后较差;与AFP相比,NEK2诊断肝癌显示出更高的灵敏度和特异度,具有更好的临床应用前景。