实验背景胰安肽(aglycin)是从大豆种子中提取得到的含有37个氨基酸残基的新生物肽,在链内具有六个半胱氨酸,依次为链内第3、7、15、20、22和32位氨基酸,该结构不仅表现为稳定的物理化学性质,而且还有广泛的生理活性。对胰安肽前期研究结果显示：胰安肽体外具有耐胃蛋白酶,胰蛋白酶和蛋白内切酶Glu-C(金黄色葡萄球菌V8蛋白酶)降解作用,同时体外具有保护胰腺p细胞的作用。本课题组对其体内药理活性进行了一系列的筛选,结果显示：胰安肽对1型糖尿病小鼠血糖并无明显的改善作用,而口服胰安肽却对2型糖尿病小鼠具有降低血糖的作用。研究目的鉴于前期对胰安肽的药理学筛选结果显示胰安肽具有口服降低2型糖尿病小鼠血糖作用,以及改善胰岛素抵抗和p细胞保护在2型糖尿病治疗中的积极作用,本课题组将对口服胰安肽对2型糖尿病的作用及机制进行研究。研究方法1.胰安肽体外对胰岛素抵抗作用研究建立HepG2细胞株高胰岛素诱导的胰岛素抵抗模型,MTT法检测胰安肽对正常和胰岛素抵抗HepG2细胞增殖的影响；检测胰安肽对正常和胰岛素抵抗HepG2细胞在胰岛素协同或不协同作用对葡萄糖消耗的影响,以及葡萄糖代谢中的重要酶葡萄糖激酶(GK),葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)的活性变化,以及肝糖原含量的变化。体外以高胰岛素诱导HepG2细胞胰岛素抵抗,研究胰安肽对胰岛素敏感性相关重要分子(PPAR-y, IRs, p-IRs, p-IRS1, p-Akt, GLUT4,膜GLUT4)的影响；并通过siRNA沉默IR,检测胰安肽对葡萄糖消耗以及胰岛素受体信号通路的影响。2.胰安肽体外对高糖所致NIT-1细胞损伤的保护作用研究采用33.3mmol/L的高糖环境诱导NIT-1细胞损伤,通过检测细胞活力和胰岛素分泌水平,研究胰安肽对NIT-1细胞的保护和促胰岛素分泌作用。3.胰安肽体内降糖作用研究采用高脂饲料喂养和腹腔注射STZ诱导2型糖尿病小鼠模型,通过检测血糖,总胆固醇,甘油三酯的水平,研究胰安肽降低血糖血脂的作用；通过检测血清胰岛素,口服糖耐量,胰岛素耐受测试,研究胰安肽对葡萄糖的利用和改善胰岛素敏感性的作用；通过检测肌肉组织和脂肪组织中果糖激酶(HK),苹果酸脱氢酶(MDH),肝脏组织GK和G-6-Pase的活性的变化,研究胰安肽对外周组织重要葡萄糖代谢酶的影响；通过real-time PCR检测肌肉、肝脏、脂肪组织IRs,IRS1, Akt, GLUT4基因表达的变化和WB检测肌肉组织IRs, IRS1, Akt, GLUT4及磷酸化蛋白p-IRs, p-IRS1, p-Akt的变化,明确胰安肽对胰岛素信号通路的影响。4.胰安肽口服吸收特点研究采用HPLC检测口服胰安肽后小鼠体内胰安肽的浓度。研究结果1.胰安肽体外对胰岛素抵抗作用研究胰安肽对正常和胰岛素抵抗HepG2细胞具有促进增殖作用,当胰安肽浓度达到0.3mM时,胰安肽促增殖作用与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)。0.2mM胰安肽使正常HepG2细胞对葡萄糖的摄取率高达50%以上,显著高于空白对照组对葡萄糖26%左右的摄取率。在正常HepG2细胞内,在加入或不加入胰岛素刺激胰岛素信号通路时,胰安肽各剂量组均能有效促进葡萄糖摄取的作用,此时,0.2mM胰安肽对葡萄糖的摄取率在60%以上和50%以上。在胰岛素抵抗HepG2细胞内,在加入或不加入胰岛素刺激胰岛素信号通路时,胰安肽各剂量组对葡萄糖的摄取明显高于模型对照组,且呈剂量依赖性。当正常的HepG2细胞在药物作用24h后,二甲双胍和胰安肽均能促进GK活性,降低G-6-Pase活性,但各组间无显著性差异。采用胰岛素作用15min后,激活胰岛素信号通路,在胰岛素的协同作用下,胰安肽能显著性增加GK活性,降低G-6-Pase活性(P<0.05,与溶剂对照组相比)。在胰岛素抵抗HepG2细胞内,胰安肽在胰岛素协同或不协同的条件下,均能显著增加GK活性和降低G-6-Pase活性活性。当正常的HepG2细胞在药物作用24h后,在胰岛素协同或不协同作用下,二甲双胍和胰安肽均能增加糖原含量,但各组间无显著性差异。采用高胰岛素环境诱导HepG2细胞胰岛素抵抗,胰安肽在胰岛素协同或不协同的条件下,均能显著升高糖原含量。胰岛素抵抗HepG2细胞中,胰安肽体外并不能直接促进PPAR-γ的表达；胰安肽可明显增加细胞IRs, p-IRs, p-IRS1和p-Akt的蛋白表达。该结果说明,胰安肽具有增加胰岛素受体数量的作用,且具有增强其功能(即蛋白磷酸化)作用。本研究发现,胰安肽协同胰岛素可显著促进细胞膜上GLUT4的含量；胰安肽可增加总的GLUT4含量,但并不十分明显。该结果说明,胰安肽主要通过促进胰岛素受体的表达增加,活化胰岛素信号,促进GLUT4膜转位,从而有利于葡萄糖转运,增加其在细胞内的利用。使用siRNA技术沉默IRs基因后,未用胰岛素刺激胰岛素信号通路时,可以逆转胰安肽诱导对葡萄糖的消耗,从35%降到15%；采用胰岛素刺激胰岛素信号通路后,IRs基因的沉默可以逆转胰安肽诱导对葡萄糖的消耗,从45%降到30%。但在胰岛素的协同作用下,胰安肽发挥促葡萄糖作用更明显。对沉默细胞的蛋白水平检测发现,胰安肽作用于基因沉默的细胞后,IRs的表达明显低于正常细胞,说明沉默IRs可以逆转胰安肽对IRs表达的诱导作用。此外,沉默IRs可以逆转胰安肽对p-IRS1, p-Akt, GLUT4的诱导作用。2.胰安肽体外对高糖所致NIT-1细胞损伤的保护作用研究胰安肽对NIT-1细胞具有保护作用,但不显著促进细胞胰岛素的分泌。3.胰安肽体内降糖作用研究给药期间,胰安肽能显著降低2型糖尿病小鼠血糖,但对小鼠体重无明显改善作用；口服胰安肽可改善小鼠糖耐量异常,其作用与二甲双胍相当；胰安肽降低血糖葡萄糖-时间曲线下面积,增强外周组织胰岛素的活动,从而增加对葡萄糖的利用；胰安肽降低血清总胆固醇和甘油三酯水平,但对血清胰岛素无显著影响；胰安肽升高脂肪和肌肉组织中已糖激酶和苹果酸脱氢酶活性,升高肝脏GK和降低G-6-Pase的活性。RT-PCR检测肌肉脂肪肝脏组织中胰岛素信号通路相关基因表达结果显示：胰安肽具有逆转胰岛素抵抗所致的IRs, IRSl的基因表达的降低,但对Akt及GLUT4无明显改善作用。WB结果显示,胰安肽增加肌肉组织IRs和IRS1总蛋白的表达水平,但不能增加Akt总蛋白的表达水平,同时胰安肽能够显著改善IRs,IRS1, Akt蛋白磷酸化水平。胰安肽对GLUT4总蛋白水平无影响,但是能促进GLUT4到达细胞膜,增加GLUT4在膜上的转运葡萄糖的功能。4.胰安肽口服吸收特点研究口服给予胰安肽60mmin后,可在血浆中检测到完整的胰安肽成分。研究结论1.体外胰安肽具有促进HepG2细胞葡萄糖摄取作用,该作用伴随着GK活性升高,G-6-Pase活性的降低,以及糖原含量的增加。该作用与胰安肽改善胰岛素受体信号通路有关。2.胰安肽可保护NIT-1细胞,但是对胰岛素分泌无显著促进作用。3.口服胰安肽具有改善2型糖尿病小鼠糖脂代谢的作用,该作用一方面与其促进胰岛素受体的表达有关；另一面与其促进蛋白磷酸化,发挥胰岛素增敏作用有关。4.口服胰安肽后,可在血浆中检测到胰安肽。