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睾丸生殖细胞肿瘤（Testicular germ cell tumors,TGCTs）是一组由不同的病理组织类型和临床表现构成的多样性肿瘤,来源于功能失调的胚胎生殖细胞,可发生于生殖腺或生殖腺外。TGCTs在年轻男性中常见,其发病率在世界大部分地区处于上升趋势。TGCTs可分为两种主要的组织学类型,精原细胞瘤和非精原细胞瘤,后者包括胚胎癌、畸胎瘤、绒毛膜癌和卵黄囊肿瘤等。其中,胚胎癌细胞（Embryonal carcinoma,EC）属于TGCTs中恶性程度最高的一种类型,被认为是与胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ES）对应的恶性细胞,因为两者都具有多能性。TGCTs对放疗和化疗敏感,大多数TGCTs患者预后良好,但仍有15-30%的转移患者预后不良甚至死亡,提示可能还存在一些未知的异常遗传因素导致TGCTs的恶性转化。然而,TGCTs恶性转化的遗传驱动因素至今尚未完全阐明。因此,寻找新的TGCTs诊断标志物及治疗靶点很有必要。到目前为止,通过全基因组关联研究（genome-wide association studies,GWAS）已发现了50多个TGCTs易感性位点,其中许多易感性位点位于基因组的非编码区域,提示包括micro RNA在内的非编码RNA可能影响TGCTs的发生发展。因此,miRNAs有望为TGCTs的诊断、预后和治疗带来突破。miR-196a-5p是一种保守的miRNA,由其前体miR-196a衍生而来。研究表明,miR-196a-5p与肿瘤发生相关,例如在胃肠道间质瘤中起癌基因的作用,或在恶性黑色素瘤中发挥抑癌基因的作用,但其在TGCTs中的作用及其机制尚不清楚。近年来,一系列的研究表明,神经细胞是肿瘤微环境的重要组成部分之一。癌细胞通过分泌神经营养因子吸引神经纤维,刺激神经生长。反过来,各种神经营养生长因子/受体在癌症中上调以促进癌细胞的存活、增殖和侵袭。例如发现胃癌和结肠直肠癌干细胞具有产生神经元细胞的潜力。然而,关于肿瘤的神经发生或肿瘤神经依赖性中的关键驱动或调控因素还未完全被确定,有待深入研究。本论文以miR-196a-5p为研究对象,分析了miR-196a-5p在TGCTs中的表达特点以及对TGCTs细胞生物学行为的影响,确定了核受体基因NR6A1是miR-196a-5p的作用靶点,并明确了NR6A1具有促进TGCTs增殖、迁移和侵袭的作用,同时证实细胞粘附分子E-cadherin是NR6A1在TGCTs中的一个新的靶基因,并从机制上探讨了NR6A1与E-cadherin的调控关系。此外,从肿瘤细胞神经发生的角度研究了NR6A1在参与调控EMT过程以及促进睾丸肿瘤细胞的神经样特征转变中的作用,阐释了miR-196a-5p/NR6A1/E-cadherin各分子间的相互调控关系,为TGCTs的诊治提供了潜在的分子靶点。本论文的主要研究内容及结果如下:（1）miR-196a-5p抑制睾丸胚胎癌细胞的增殖、迁移和侵袭:利用GEO数据库分析结合临床样本RT-q PCR检测,证实miR-196a-5p在睾丸生殖肿瘤组织中表达下调。随后,采用MTT实验、划痕实验、Transwell实验以及Western Blot检测,发现miR-196a-5p可明显抑制NT-2和NCCIT睾丸胚胎癌细胞的增殖、迁移和侵袭,表明miR-196a-5p在TGCTs中可能发挥肿瘤抑制作用。（2）miR-196a-5p靶基因的确定与功能验证:利用Targetscan下载miR-196a-5p所有靶基因并和GO数据库中所有增殖分化相关基因取交集后,筛选得到排名第一的靶基因为核受体基因NR6A1。通过生信分析和PCR实验证明了miR-196a-5p和NR6A1在TGCTs中的表达呈现负相关。通过Western blot,RT-q PCR以及双荧光素酶报告基因实验证明了miR-196a-5p靶向识别和降解NR6A1。进一步的功能拯救实验证实NR6A1可以部分回补miR-196a-5p对胚胎癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。（3）核受体NR6A1靶向抑制CDH1促进胚胎癌细胞的增殖、迁移和侵袭:利用RNA sequnce检测过表达NR6A1后对NT-2细胞的影响,GO分析发现过表达NR6A1可以显著负向调节NT-2细胞的细胞粘附行为。通过RT-q PCR、Western blot、免疫荧光等实验发现NR6A1显著抑制粘附分子E-cadherin的表达。进一步通过分析CDH1（E-cadherin编码基因）启动子区域的DR0位点,发现CDH1基因上面含有三个DR0位点。随后利用Western blot、染色质免疫共沉淀（CHIP）-PCR、双荧光素酶报告基因实验等方法确认了CDH1是NR6A1在TGCTs中的一个新的靶基因。功能拯救实验证实干扰CDH1可以部分回补干扰NR6A1对胚胎癌细胞增殖,迁移,侵袭的抑制。在机制上,通过CO-IP发现NR6A1可以和甲基化酶Dnmt1相互作用调节CDH1的甲基化水平,提示NR6A1可能通过募集Dnmt1至CDH1的启动子DR0位点处,甲基化CDH1的启动子,抑制其转录。此外,基于Starbase数据库的临床样本分析证明了miR-196a-5p/NR6A1/CDH1在TGCTs中存在相互调控关系。（4）NR6A1促进胚胎癌细胞的神经样特征转变:体外裸鼠成瘤实验表明过表达NR6A1的NT-2细胞异种移植肿瘤的增长率明显高于对照组,NR6A1过表达促进了NT-2细胞体外成瘤。免疫组化实验检测发现过表达NR6A1后瘤体中增殖标志分子PCNA和神经特异性标记分子MAP2的表达水平显著上升。体外构建了视磺酸（RA）诱导的胚胎癌NT-2细胞神经样转变模型,利用该模型检测了NR6A1干扰后MAP2的表达变化。结果证实干扰NR6A1后,MAP2的表达不再随RA的诱导而出现,提示了NR6A1可能在TGCTs细胞的神经样特征转变中发挥作用。（5）miR-196a-5p/NR6A1/E-cadherin轴调控TGCTs的发生发展:利用体外RA诱导NT-2神经样特征转变的细胞模型,探讨了miR-196a-5p/NR6A1/E-cadherin在胚胎癌细胞神经样转变过程中的相互调控关系。发现随RA浓度不断升高,NR6A1和N-cadherin的表达水平不断升高;OCT4和E-cadherin的表达水平逐渐下降。miR-196a-5p的表达与NR6A1的水平呈现互反,再次证明了miR-196a-5p与NR6A1在TGCTs中存在靶向关系。而且,发现RNA干扰NR6A1或者过表达miR-196a-5p抑制NR6A1后,均可以影响胚胎癌细胞神经样改变过程中E-cadherin/N-cadherin之间的表达转换,暗示NR6A1可能调控了EMT过程。为了在组织水平证明NR6A1、E-cadherin和MAP2在TGCTs中的相关性,收集了15例睾丸生殖细胞肿瘤组织及15例正常睾丸组织病理切片标本进行免疫组化分析。结果表明,与正常睾丸组织相比,NR6A1在TGCTs中高表达;E-cadherin在TGCTs中低表达;MAP2在TGCTs中高表达。相关性分析表明E-cadherin与MAP2在TGCTs中的表达相关性不显著;而NR6A1与E-cadherin表达呈负相关,NR6A1与MAP2则呈正相关,表明NR6A1在胚胎癌细胞发生神经样特性转变中发挥重要作用。