背景:膀胱癌（Bladder Cancer,BC）是泌尿外科常见的恶性肿瘤之一。在世界范围内,膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第9位。在欧美国家,男性膀胱癌发病率居恶性肿瘤第4位。据2018年统计,全球膀胱癌死亡人数高达199922例。近年来,我国膀胱癌发病率和死亡率不断攀升,严重危害我国居民健康。但目前对晚期膀胱癌仍缺乏有效的治疗手段,导致患者预后差,死亡率高,5年总体生存率仅有25%-35%。因此,需要更加深入的研究膀胱癌发生、发展及预后的具体分子机制,探索治疗膀胱癌新的靶点,寻找个性化和精准化的治疗方案。膀胱癌的发生和发展是复杂多变的过程,受内在因素和外在因素的共同影响。其中肿瘤细胞的生长与凋亡基因调节失控,导致肿瘤细胞不断生长。肿瘤细胞为了适应快速的生长,通过改变细胞本身的新陈代谢方式,促进肿瘤的快速增殖。众多研究发现一碳单位代谢参与氨基酸与核苷酸等物质的合成,对肿瘤的快速增殖具有重要意义。亚甲基四氢叶酸脱氢酶2（Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2,MTHFD2）是一碳代谢中的关键酶,在多种肿瘤中也发挥重要的作用。如MTHFD2在神经胶质瘤、头颈部鳞状细胞癌、食道鳞状细胞癌、肝细胞癌、肾细胞癌中高表达,并且与患者预后密切相关,被认为可以作为一个独立的生物标记来预测预后。有研究发现MTHFD2参与了肿瘤免疫细胞浸润过程。肿瘤微环境（Tumor Microenvironment,TME）对于认识肿瘤的发生、发展、转移等有着重要的意义,而且对于肿瘤的诊断、防治和预后亦有着重要的作用。其中,免疫细胞浸润在肿瘤微环境中发挥重要作用,对肿瘤的发生、发展和预后起到极大的作用。免疫逃逸成为肿瘤治疗效果不佳的重要因素,免疫细胞表面和肿瘤细胞表面的程序性死亡受体-1（Programmed death 1,PD-1）和程序性死亡配体-1（Programmed death ligand 1,PD-L1）相结合,成为肿瘤细胞免疫逃逸的重要机制。目前在多种肿瘤免疫治疗方面成为研究的热点问题。然而,MTHFD2的表达与膀胱癌免疫细胞浸润和PD-L1表达对膀胱癌的进展及预后的影响很少有相关报道。目的:本课题首要目的是了解MTHFD2在膀胱癌中的表达情况,与临床分期和预后的关联;明确MTHFD2对膀胱癌细胞增殖的影响;探索MTHFD2的表达与膀胱癌免疫细胞浸润和PD-L1表达的关系和作用机制。寻找膀胱癌药物治疗敏感性的指标,为膀胱癌的诊治提供新的思路和方法。方法:1.为了明确MTHFD2在膀胱癌中的表达情况和预后的相关性。我们利用TIMER和TCGA在线数据库分析MTHFD2在膀胱癌和癌旁组织中的表达情况;通过免疫组化、实时荧光定量PCR（RT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）检测临床样本中膀胱癌及癌旁组织中MTHFD2的表达情况;通过RTPCR检测膀胱癌细胞系和正常尿路上皮永化生细胞（SV-HUC-1）中MTHFD2的表达情况。通过TCGA数据库和膀胱癌组织微阵列（Tissue Microarray,TMA）分析MTHFD2的表达与临床分期和预后的关系;通过单因素和多因素Cox回归分析探索影响膀胱癌总体生存率的可能影响因素。2.为了明确MTHFD2的表达与膀胱癌免疫细胞浸润的相关性。我们通过使用TIMER数据库探索MTHFD2的表达与膀胱癌免疫细胞浸润和免疫相关分子的相关性。使用ESTIMATE计算肿瘤微环境相关得分。通过免疫组化检测膀胱癌TMA中癌和癌旁组织CD8和PD-L1的表达。3.为进一步证实MTHFD2在膀胱癌中具有促进肿瘤增殖的作用。我们使用慢病毒转染法稳定敲低膀胱癌细胞系（T24和UMUC3）中的MTHFD2基因,并通过RT-PCR和WB进行验证。再使用CCK-8和细胞克隆实验检测细胞增殖能力;通过流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化。通过裸鼠体内成瘤实验观察低表达MTHFD2的膀胱癌细胞体内生长的情况。最后通过WB和免疫组化证实低表达MTHFD2对PD-L1表达的影响。4.为了进一步探索MTHFD2影响膀胱癌增殖的机制。我们通过TCGA数据库分析差异表达基因,利用生物信息学方法分析差异表达基因功能蛋白富集的相关信号通路。同时通过第二代高通量m RNA测序（RNA-seq）分析证实沉默MTHFD2的膀胱癌细胞差异表达基因和富集的经典信号通路。通过WB实验检测低表达MTHFD2的膀胱癌细胞中PI3K/AKT（磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B）信号通路相关蛋白（PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT）和PD-L1的表达。再通过一系列的功能回复实验证实PI3K激动剂（740Y-P）能否恢复低表达MTHFD2的膀胱癌细胞增殖能力和PD-L1的表达。5.为了了解MTHFD2的表达与临床药物敏感性的关系,利用癌症药物敏感性基因组学（GDSC）数据库分析临床常用化疗药物和相关靶向药物与MTHFD2表达的相关性,为指导临床用药提供参考价值。结果:1.MTHFD2在膀胱癌中高表达,且与预后呈负相关性。首先,我们通过TIMER在线数据库分析发现MTHFD2在多种肿瘤中高表达,且在BC中也呈高表达。TCGA数据库显示414例BC组织与19例正常膀胱组织相比,MTHFD2在BC组织中呈高表达。同时19例BC标本与其匹配的正常膀胱组织标本进行比较,得到了相似的结果。其次,膀胱癌组织微阵列（TMA）也证实BC组织中MTHFD2的表达高于正常组织。同时RT-PCR显示MTHFD2在膀胱癌细胞系（UMUC3、T24、J82、EJ、BIU、5637）中的表达高于SV-HUC-1。此外,我们用RT-PCR方法检测了24对临床BC样本组织和癌旁组织以及用WB检测6对高级别膀胱癌及癌旁组织,均观察到BC中MTHFD2的表达均高于癌旁组织。最后,在TCGA数据库和TMA中我们观察到MTHFD2的表达与TNM分期及AJCC分期密切相关,且MTHFD2表达升高的患者总生存期（Overall Survival,OS）显著降低。单因素COX回归分析显示AJCC分期、TNM-T分期、TNM-N分期、年龄和MTHFD2表达与BC患者的OS显著相关（P＜0.05）。多因素COX回归分析显示年龄具有显著相关性,而MTHFD2的表达与患者的OS有相关趋势。2.MTHFD2表达与膀胱癌免疫细胞浸润的关系。首先,利用TIMER数据库研究了MTHFD2的表达与膀胱癌免疫浸润的关系,发现MTHFD2的表达与肿瘤纯度呈负相关,与中性粒细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、巨噬细胞呈正相关。同时,使用CIBERSORT分析22个免疫细胞的免疫浸润评分,发现记忆B细胞、浆细胞、滤泡辅助性T细胞、调节性T细胞、单核细胞、MO型巨噬细胞、M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞、初始CD4+T细胞、活化CD4+T细胞、活化的髓样树突状细胞、活化肥大细胞、静息肥大细胞和中性粒细胞在MTHFD2低表达组和高表达组之间有统计学差异。此外,我们还发现MTHFD2的表达与各种免疫相关分子显著相关,包括免疫刺激物、免疫抑制物、MHC分子、趋化因子和受体。特别是MTHFD2与免疫检查点分子之间的关联,与CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1LG2、TIGIT和SIGLEC15的表达呈正相关。且肿瘤突变负荷（Tumor Mutation Burden,TMB）和MTHFD2的表达呈显著正相关。比较TCGA数据库中肿瘤微环境（TME）相关评分,发现MTHFD2高表达的样本具有较高的综合评分、免疫细胞评分和基质细胞评分。最后,膀胱癌组织微阵列验证了MTHFD2表达和CD8/PD-L1表达呈显著正相关。3.MTHFD2在膀胱癌中的致癌作用。我们构建了稳定下调MTHFD2表达的T24和UMUC3膀胱癌细胞系。RTPCR和WB证实病毒转染后T24和UMUC3细胞低表达MTHFD2。通过CCK-8和细胞克隆实验证实T24-sh RNA2和UMUC3-sh RNA2细胞的增殖能力显著降低,流式细胞仪显示MTHFD2沉默后的膀胱癌细胞停滞在G0/G1期,且晚期凋亡细胞明显增多。裸鼠体内实验也证实了T24-sh RNA2移植瘤增殖速度明显减慢。同时T24-sh RNA2细胞和异种移植瘤中PD-L1的表达也明显下调。4.MTHFD2基因沉默通过PI3K/AKT信号通路抑制膀胱癌细胞的增殖。首先,分析TCGA数据库发现2319个上调和639个下调的差异基因。通过功能富集分析发现MTHFD2的功能与多种代谢途径有关,并与免疫调节有关,如T细胞激活、细胞因子的产生和相互作用、DNA复制和细胞周期调节等。经典信号通路磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶标（m TOR）显著富集。同样,RNA-seq共发现了367个上调和120个下调的差异基因。在富集分析中,MTHFD2的功能与细胞因子活性、趋化因子受体结合和代谢过程等相关。GSVA（ss GSEA）分析表明,MTHFD2的表达与PI3K/AKT通路的激活呈显著正相关。因此,我们接下来进一步证实MTHFD2影响BC细胞增殖是通过抑制PI3K/AKT信号通路。WB显示沉默MTHFD2后,T24细胞p-PI3K和p-AKT显著降低,而总PI3K和AKT无明显变化,从而导致pPI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值下降。当740Y-P作用于T24-sh RNA2细胞时,p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白水平呈剂量依赖性增加。最后,功能回复实验表明,740Y-P刺激T24-sh RNA2细胞后增殖和细胞克隆能力得到部分恢复,凋亡细胞数量较前减少,且PD-L1的表达较前升高。这些结果表明,MTHFD2在膀胱癌中的作用部分是通过PI3K/AKT信号通路实现的。5.MTHFD2可作为膀胱癌化疗和靶向药物治疗敏感性指标。我们利用GDSC数据库预测MTHFD2表达与BC多种药物敏感性之间的关系。这些药物主要分为两类,一类是临床指南中推荐的常规化疗药物,另一类是针对PI3K/AKT通路的药物。MTHFD2的表达与常规化疗药物的IC50呈显著负相关（P＜0.05）,包括阿霉素、顺铂、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、5-氟尿嘧啶、喜树碱、长春花碱和吉西他滨。同时,MTHFD2的表达与PI3K/AKT通路靶向药物的IC50也呈显著负相关,包括A.443554、PF.4708671、AZD6482、TGX221、PIK-93和YM201636,而且与AKT抑制剂VIII呈正相关。这些结果表明,MTHFD2可作为治疗膀胱癌潜在的药物敏感性指标。结论:我们发现MTHFD2在膀胱癌组织中高表达,且与肿瘤分期、预后不良、肿瘤免疫细胞浸润、PD-L1表达密切相关。低表达MTHFD2的膀胱癌细胞增殖能力、细胞克隆形成能力明显降低,凋亡细胞数量明显增多,且在异种移植裸鼠模型中得到了证实。我们还发现MTHFD2基因下调抑制膀胱癌细胞的增殖是通过抑制PI3K/AKT信号通路,同时下调了PD-L1的表达。且MTHFD2的表达与传统的化疗药物和PI3K/AKT信号通路靶向药物敏感性相关。综上所述,MTHFD2通过PI3K/AKT信号通路调控膀胱癌细胞增殖和PD-L1的表达。MTHFD2可能成为膀胱癌化疗和免疫治疗的潜在标记物和治疗靶点。