本论文首先通过动物试验,在幼建鲤蛋白需要量水平的日粮基础上降低2个百分点蛋白后添加不同水平的酶解大豆蛋白,考察其对幼建鲤生长性能、营养物质沉积和氮磷排放的影响,研究酶解大豆蛋白是否具有节约鱼类日粮蛋白的作用,并确定其适宜用量;进一步考察酶解大豆蛋白对幼建鲤消化吸收能力、肠道抗氧化能力和免疫力的影响,揭示其作用机制。再通过体外分离、纯化、结构鉴定和细胞验证试验,确定酶解大豆蛋白中的效应物质。主要研究内容和结果如下:1酶解大豆蛋白在幼建鲤日粮中节约蛋白的作用及机理研究1.1酶解大豆蛋白对幼建鲤生长性能、营养物质沉积、氮磷排放的影响选择健康幼建鲤共1400尾,初始体重11.96±0.05 g,进行56 d的生长试验。开展生长试验的同时,选择健康幼建鲤共1050尾,初始体重39.17±1.84 g,进行消化率试验。两个试验都设7个处理,分别饲喂日粮1（34%CP）、日粮2（32%CP）和日粮3-7（分别在日粮2基础上添加1.0、1.5、2.0、2.5和3.0%酶解大豆蛋白）。通过生长试验和消化率试验,考察酶解大豆蛋白对幼建鲤生长性能、营养物质沉积、氮磷排放的影响。结果发现:34%CP日粮基础上降低2个百分点蛋白,FBW、PWG、SGR和FI显著降低（P<0.05）。灰分、钙、磷沉积率显著提高（P<0.05）,脂肪沉积率显著降低（P<0.05）。蛋白质和磷表观消化率有提高的趋势（P>0.05）。氮排放量显著降低（P<0.05）,磷排放量有降低的趋势（P>0.05）。当在32%CP日粮基础上添加1%的酶解大豆蛋白,FBW、PWG、SGR和FI显著提高（P<0.05）,并与34%CP组无显著差异（P>0.05）;蛋白、钙、磷、灰分沉积率显著高于34%CP组（P<0.05）;蛋白质和磷表观消化率有提高的趋势（P>0.05）,其中蛋白质表观消化率显著高于了34%CP组（P<0.05）;氮排放量显著降低（P<0.05）,磷排放量有降低的趋势（P>0.05）,但均显著低于34%CP组（P<0.05）。以上数据表明:在32%CP日粮基础上添加1.0%的酶解大豆蛋白（只提供0.46个百分点蛋白）,可以节约2个百分点蛋白,达到与34%CP组相当的生长性能。1.2酶解大豆蛋白对幼建鲤消化吸收能力的影响及机制试验设计同上,在幼建鲤蛋白需要量水平的日粮基础上降低2个百分点蛋白后添加不同水平的酶解大豆蛋白,考察其对肝胰脏和肠道生长发育、肠道皱襞高度、消化吸收酶活力及基因表达的影响,揭示酶解大豆蛋白节约鱼类日粮蛋白的部分作用机制。结果发现:34%CP日粮基础上降低2个百分点蛋白,IL、RGL、IW显著降低（P<0.05）,ISI和IPC含量有降低的趋势（P>0.05）。肝胰脏糜蛋白酶、肠道脂肪酶和淀粉酶活力显著降低（P<0.05）。后肠的Na⁺-K⁺-ATPase和前中后肠的CK活力显著降低（P<0.05）。肝胰脏中胰蛋白酶2基因的表达量显著降低（P<0.05）,淀粉酶、脂肪酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶1基因的表达量有降低趋势（P>0.05）。前肠和后肠Na⁺-K⁺-ATPase（α1a.4）亚型基因的表达量无显著变化（P>0.05）,中肠Na⁺-K⁺-ATPase（β1a）亚型基因的表达量显著提高（P<0.05）。前中后肠的γ-GT、AKP、CK（1/2/3）基因的表达量无显著变化（P>0.05）。4E-BP2基因的表达量有提高的趋势,TOR基因的表达量有下降的趋势（P>0.05）。当在32%CP日粮基础上添加1.0-1.5%的酶解大豆蛋白,HW、HSI、HPC、IL、RGL、IW、ISI、IPC均显著提高（P<0.05）,其中HW、HSI、HPC、IL显著高于了34%CP组（P<0.05）。中肠和后肠的皱襞高度显著提高（P<0.05）。肝胰脏和肠道的消化酶活力显著提高（P<0.05）,而且胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶活力显著高于了34%CP组（P<0.05）。前中后肠的CK、Na⁺-K⁺-ATPase、γ-GT和AKP活力均显著提高（P<0.05）。除后肠的Na⁺-K⁺-ATPase、γ-GT和AKP外,其他肠段的吸收酶活力显著高于了34%CP组（P<0.05）。肝胰脏中淀粉酶、脂肪酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶2基因的表达量均显著提高（P<0.05）,胰蛋白酶1基因的表达量无显著影响（P>0.05）,其中淀粉酶和脂肪酶基因的表达量显著超过了34%CP组（P<0.05）。除前肠的Na⁺-K⁺-ATPase（β1a）亚型外,其余肠段的Na⁺-K⁺-ATPase基因亚型的表达量均显著提高（P<0.05）,且显著高于34%CP组（P<0.05）。中肠γ-GT、中肠AKP、后肠γ-GT基因的表达量显著提高（P<0.05）,后肠AKP基因的表达量显著降低（P<0.05）。中肠和后肠CK1、中肠CK2、前肠CK3基因的表达量显著提高（P<0.05）,并显著高于34%CP组（P<0.05）。前中后肠TOR基因的表达量显著提高（P<0.05）,并显著高于34%CP组（P<0.05）。前中后肠4E-BP2基因的表达量显著降低（P<0.05）。1.3酶解大豆蛋白对幼建鲤肠道抗氧化能力和免疫力的影响及机制试验设计同上,在幼建鲤蛋白需要量水平的日粮基础上降低2个百分点蛋白后添加不同水平的酶解大豆蛋白,考察其对肠道溶菌酶活力,C3/C4水平,IgM水平,抗氧化相关指标,抗氧化酶、细胞因子、Nrf2和Keap1a基因表达的影响,进一步揭示酶解大豆蛋白能够节约鱼类日粮蛋白的作用机制。结果发现:34%CP日粮基础上降低2个百分点蛋白,肠道补体C3/C4和IgM水平、溶菌酶活力均无显著影响（P>0.05）。促炎因子TNF-α和IL-1β2-1基因的表达量显著提高（P<0.05）。肠道中PC含量显著提高（P<0.05）,MDA、T-AOC、ASA和AHR无显著变化（P>0.05）,T-SOD活力显著降低（P<0.05）,GSH含量显著提高（P<0.05）。MnSOD、CuSOD、CAT、GR、GPx1a和Nrf2基因的表达量有降低趋势,Keap1a基因的表达量有升高趋势（P>0.05）。当在32%CP日粮基础上添加1.5%的酶解大豆蛋白,肠道溶菌酶活力和IgM水平显著提高（P<0.05）,且显著高于34%CP组（P<0.05）。IL-1β2-1、IL-1β2-2、TNF-α基因的表达量均显著降低（P<0.05）,且TNF-α基因的表达量显著低于34%CP组（P<0.05）。IL-10基因的表达量显著提高（P<0.05）,且显著高于34%CP组（P<0.05）,但对TGF-β2基因的表达量无显著影响（P>0.05）。肠道MDA和PC含量显著降低（P<0.05）,T-AOC和AHR显著提高（P<0.05）,其中MDA含量显著低于34%CP组,T-AOC和AHR显著高于34%CP组（P<0.05）。SOD、CAT、GST活力均显著提高（P<0.05）,且显著高于34%CP组（P<0.05）。Keap1a基因的表达量显著降低（P<0.05）,SOD、CAT、GR、GPx1a、Nrf2基因的表达量显著提高（P<0.05）,其中SOD和GR基因的表达量显著高于34%CP组（P<0.05）。2酶解大豆蛋白水溶部分中抗氧化活性肽的分离和结构鉴定通过分离、纯化、结构鉴定的研究手段,获得酶解大豆蛋白中含量高且抗氧化活性强的功能肽的氨基酸结构。结果发现:酶解大豆蛋白水溶部分的分子量主要集中在100¹000 Da,此分子量区域占水溶蛋白的80%;还有少量集中在1000¹0000 Da,此分子量区域占水溶蛋白的20%。进一步对酶解大豆蛋白水溶部分超滤获得的大于10 kDa、5-10 kDa、3-5 kDa、1-3 kDa和小于1 kDa的五个分子量区段组分进行抗氧化活性检测。结果发现:ABTS⁺·清除能力和FRAP铁离子还原力均随着分子量的降低而升高,当分子量小于1000 Da时最强。亚铁离子鳌合能力与分子量无相关性,但也是分子量小于1000 Da时最强。进一步用反相高效液相色谱分离纯化小于1000 Da组分,可获得含量靠前13位的不同极性的组分。以GSH的ABTS⁺·清除能力作为对标,发现其中有6个组分的ABTS⁺·清除能力较强,达到了GSH的50%及以上。最后,通过色谱和质谱联用办法,确定有2个组分是肽,且都在大豆蛋白序列中找到了相应匹配的蛋白和氨基酸序列。其中组分9序列100%概率为Ala-Phe;组分5序列存在两种可能,82.4%概率为Glu-Tyr,17.6%概率为Tyr-Glu。3 Glu-Tyr和Ala-Phe二肽对建鲤肠细胞的抗氧化损伤作用及其机制的验证3.1 Glu-Tyr和Ala-Phe二肽对建鲤肠细胞的抗氧化损伤作用通过细胞验证试验考察不同水平的Glu-Tyr和Ala-Phe二肽对建鲤肠细胞MDA和PC含量,以及培养液中LDH活力的影响,研究两种二肽对鱼肠细胞氧化损伤的影响及适宜添加量。结果发现:MDA和PC含量均随Glu-Tyr添加水平提高而显著降低（P<0.05）,当浓度达到320 mg/L时最低,进一步增加Glu-Tyr的添加水平,MDA和PC含量又显著升高（P<0.05）。细胞培养液中LDH活力也随着Glu-Tyr水平的升高而显著降低（P<0.05）,当浓度达到320 mg/L后维持稳定。随着Ala-Phe添加水平提高,MDA和PC含量显著降低（P<0.05）,当浓度达到240 mg/L时,二者量最低,进一步增加Ala-Phe的添加水平,二者含量又显著升高（P<0.05）。但细胞培养液中LDH活力随着Ala-Phe水平的升高无显著变化（P>0.05）。3.2 Glu-Tyr和Ala-Phe二肽对建鲤肠细胞氧化损伤的保护作用及机制通过细胞验证试验考察适宜水平的Glu-Tyr和Ala-Phe二肽对H₂O₂诱导的建鲤肠细胞氧化损伤的保护作用及机制。结果发现:H₂O₂应激使肠细胞中MDA和PC含量显著升高（P<0.05）,CAT和GPx活力显著降低（P<0.05）。当先用Glu-Tyr培养后再用H₂O₂应激,MDA和PC含量显著降低（P<0.05）,CAT和GPx活力显著提高（P<0.05）。基因表达的结果发现:当用Glu-Tyr培养时,Keap1a基因的表达量显著降低（P<0.05）,Nrf2基因的表达量显著升高（P<0.05）,MnSOD、GPx1a和GPx4a基因的表达量显著提高（P<0.05）。当Glu-Tyr培养后用H₂O₂应激,与Glu-Tyr组比,Keap1a基因的表达量显著升高（P<0.05）,MnSOD、GPx1a和GPx4a基因的表达量均有降低的趋势（P>0.05）。当先用Nrf2抑制剂后添加Glu-Tyr之后用H₂O₂应激,与对照组相比,Nrf2基因的表达量有提高的趋势（P>0.05）,Keap1a基因的表达量显著降低（P<0.05）,MnSOD、GPx1a、GPx4a基因的表达量均有提高的趋势（P>0.05）。当先用Ala-Phe培养后再用H₂O₂应激,MDA含量显著降低（P<0.05）,PC含量有降低的趋势（P>0.05）,CAT、GPx和T-SOD活力显著提高（P<0.05）。基因表达的结果发现,当用Ala-Phe培养时,Nrf2基因的表达量显著升高（P<0.05）,GPx1a和GPx4a基因的表达量显著提高（P<0.05）,MnSOD基因的表达量有提高的趋势（P>0.05）。当Ala-Phe培养后用H₂O₂应激,与Ala-Phe组比,仅MnSOD基因的表达量显著降低（P<0.05）。当先用Nrf2抑制剂后添加Ala-Phe之后用H₂O₂应激,与对照组相比,Nrf2基因的表达量显著升高（P<0.05）。3.3 Glu-Tyr和Ala-Phe二肽对建鲤肠细胞氧化损伤的修复作用及机制通过细胞试验考察适宜水平的Glu-Tyr和Ala-Phe二肽对H₂O₂诱导的建鲤肠细胞氧化损伤的修复作用及机制。结果发现:当H₂O₂应激后添加Glu-Tyr,与H₂O₂应激组相比,肠细胞MDA和PC含量显著降低（P<0.05）,与对照组比无显著差异（P>0.05）。CAT、GPx和T-SOD活力显著提高（P<0.05）,与对照组比无显著差异（P>0.05）。基因表达的结果发现:当H₂O₂应激后添加Glu-Tyr,与仅用H₂O₂应激组相比,Keap1b基因的表达量显著降低（P<0.05）,Nrf2基因的表达显著提高（P<0.05）,MnSOD和GPx1a基因的表达量显著升高（P<0.05）。当先用Nrf2抑制剂后H₂O₂应激再添加Glu-Tyr,与对照组比,Nrf2基因的表达量有降低的趋势（P>0.05）,Keap1b和MnSOD基因的表达量有升高的趋势（P>0.05）,GPx1a基因的表达量显著降低（P<0.05）。当H₂O₂应激后添加Ala-Phe,与H₂O₂应激组相比,肠细胞MDA和PC含量显著降低,且PC含量显著低于对照组（P<0.05）。CAT、GPx和T-SOD活力显著提高（P<0.05）,与对照组比无显著差异（P>0.05）。基因表达的结果发现:当H₂O₂应激后添加Ala-Phe,与H₂O₂应激组相比,Keap1b基因的表达量显著降低（P<0.05）,MnSOD和GPx1a基因的表达量显著提高（P<0.05）。当先用Nrf2抑制剂后H₂O₂应激再添加Ala-Phe,与对照组相比,Nrf2基因的表达量显著降低（P<0.05）,Keap1a和1b基因的表达量有提高的趋势（P>0.05）,MnSOD基因的表达量显著降低（P<0.05）,GPx1a基因的表达量有降低的趋势（P>0.05）。3.4 Glu-Tyr和Ala-Phe二肽对建鲤肠细胞氧化损伤的阻截作用及机制通过细胞试验考察适宜水平的Glu-Tyr和Ala-Phe二肽对H₂O₂诱导的建鲤肠细胞氧化损伤的阻截作用及机制。结果发现:当同时添加H₂O₂和Glu-Tyr,与H₂O₂应激组相比,肠细胞的MDA和PC含量显著降低（P<0.05）,与对照组无显著差异（P>0.05）。CAT、GPx和T-SOD活力均有提高的趋势,但与对照组比无显著差异（P>0.05）。基因表达的结果发现,同时添加H₂O₂和Glu-Tyr,与只加H₂O₂组比,Keap1a基因的表达量有降低的趋势（P>0.05）,Keap1b基因的表达量显著降低（P<0.05）,Nrf2基因的表达量显著提高（P<0.05）,MnSOD和GPx1a基因的表达量显著升高（P<0.05）。当先用Nrf2抑制剂后同时添加H₂O₂和Glu-Tyr,与对照组相比,Nrf2、MnSOD、GPx1a基因的表达量有降低的趋势（P>0.05）,Keap1a和1b基因的表达量有升高的趋势（P>0.05）。当同时添加H₂O₂和Ala-Phe,与H₂O₂应激组比,肠细胞的MDA和PC含量、CAT、GPx和T-SOD活力无显著变化（P>0.05）,CAT和T-SOD活力显著低于对照组（P<0.05）,MDA和PC含量显著高于对照组（P<0.05）。基因表达的结果发现:同时添加H₂O₂和Ala-Phe,与H₂O₂应激组比,Nrf2、Keap1a/1b、CuZn/MnSOD和GPx1a/4a基因的表达量无显著变化（P>0.05）。当先用Nrf2抑制剂后同时添加H₂O₂和Ala-Phe,与对照组比,Keap1a基因的表达量显著升高（P<0.05）,Nrf2基因的表达量显著降低（P<0.05）,MnSOD和GPx1a基因的表达量显著降低（P<0.05）。综上所述:（1）在幼建鲤蛋白需要量水平的日粮（34%CP）基础上降低2个百分点蛋白会降低其生长性能,这可能与降低了消化吸收能力、肠道抗氧化能力和免疫力有关。（2）在32%CP日粮基础上添加1.0%酶解大豆蛋白,虽然只提供了0.46个百分点蛋白,但可以节约日粮中2个百分点蛋白,达到与34%CP组相当的生长性能。酶解大豆蛋白具有节约鱼类日粮蛋白的效应可能与其增强了肠道免疫力和抗氧化能力而改善了肠道健康,从而提高了鱼类的消化吸收能力有关。（3）酶解大豆蛋白水溶部分中分子量小于1000 Da部分占到80%,这部分清除自由基能力最强,从中可以获得2个抗氧化活性肽,其氨基酸序列分别为Glu-Tyr和Ala-Phe。（4）Glu-Tyr二肽对鱼肠道细胞的氧化损伤具有保护、修复和阻截作用,Ala-Phe二肽对鱼肠道细胞的氧化损伤只有保护和修复作用。Glu-Tyr和Ala-Phe二肽都是通过激活Keap1/Nrf2信号通路,从而提高抗氧化酶基因表达及其活力,对鱼肠道细胞氧化损伤起到保护或修复作用,但对信号通路上部分基因亚型的作用存在差异。