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大豆异黄酮(Soybean Isoflavones, SIF)是一种植物雌激素,广泛存在于豆科植物中。目前的观点认为,SIF会干扰动物的内分泌平衡,引发内分泌紊乱,导致繁殖力降低。本研究通过在无豆粕的日粮中添加不同浓度的SIF,探讨SIF对巴马香猪初情启动及卵泡发育的影响。试验采用单因子试验设计,从11窝胎龄相同、胎次相近的仔猪中,每窝选择5头35日龄的雌性巴马香猪,随机分配到5个处理组,分别给予0、250、500、1250 mg/kg的大豆异黄酮和0.66 mg/kg的戊酸雌二醇(相当于0.5 mg/kg的雌二醇),每个处理组11个重复,每个重复1头猪,进行动物饲养试验。试验期间,准确记录各组猪的初情日龄；在4月龄、发情第2天和第4天分别空腹采血,用于血清激素水平测定;在猪启动初情后的第4天,每组选择6头猪屠宰,采集下丘脑、垂体、卵巢等组织样品,用于荧光定量PCR、western blot、HE染色和免疫组化的检测；从剩下的猪中,每组选择3头猪于第二次发情时配种,饲喂至分娩,考察SIF对雌性巴马香猪繁殖性能的影响。此外,从附近屠宰场收集卵巢组织,分离原代颗粒细胞,探讨大豆苷元和染料木黄酮对原代颗粒细胞激素合成、GDF-9/BMP-15信号通路及凋亡的影响。试验结果如下：(1)巴马香猪日粮中添加不同浓度的SIF导致猪的初情期延迟,240日龄时猪的发情率降低,且1250 mg/kg的SIF显著增加了(P<0.05)巴马香猪的初情日龄。日粮中添加SIF显著降低了(P<0.05)4月龄巴马香猪血清中的GnRH和LH水平,增加了(P<0.05)FSH水平。250mg/kg添加水平的SIF显著降低了巴马香猪下丘脑中ER β和卵巢中ER α的mRNA表达水平,500mg/kg的SIF显著降低了下丘脑中ERβ的表达水平,1250mg/kg的SIF显著降低了垂体和卵巢中ER α的表达水平,且各添加水平的SIF降低了(P<0.05)香猪卵巢ER β的蛋白表达水平。1250 mg/kg的SIF增加了(P<0.05)垂体FSHβ的表达水平,250 mg/kg的SIF显著降低了垂体GNRHR的表达。日粮中添加各水平的SIF极显著降低了(P<0.01)巴马香猪下丘脑KISS1和卵巢StAR、 3β-HSD的mRNA表达水平和卵巢StAR的蛋白水平。250 mg/kg添加水平的SIF显著降低了(P<0.05)卵巢CYP17A1和CYP19A1的表达水平。此外,日粮中添加250 mg/kg的SIF显著降低了(P<0.05)巴马香猪卵巢组织FSHR mRNA的表达水平,各水平的SIF显著降低了(P<0.05)卵巢中FSHR蛋白的表达水平。结果提示,SIF导致巴马香猪初情期的延迟,其机制是通过改变下丘脑、垂体、卵巢中雌激素受体的表达,引起下丘脑中KISS1基因、卵巢中StAR和3 β-HSD基因和蛋白的表达下调,从而引起猪血清中激素水平的改变,导致内分泌紊乱。(2)大豆异黄酮对巴马香猪的卵巢质量、卵巢指数及初情排卵数均没有显著影响(P>0.05)。日粮中添加SIF减少了巴马香猪卵巢中各期卵泡的数量,其中,1250 mg/kgSIF显著减少了(P<0.05)原始卵泡数量,500、1250 mg/kg大豆异黄酮显著减少了(P<0.05)生长期卵泡数量。日粮中添加SIF显著降低了(P<0.05)巴马香猪卵巢组织GDF-9、BMPR-1B mRNA的表达水平,250 mg/kg的SIF显著降低了(P<0.05)卵巢BMP-15、BMPR2的mRNA的表达水平；各水平的SIF显著降低了(P<0.05)巴马香猪卵巢中BMP-15蛋白的表达水平。日粮添加SIF显著降低了(P<0.05)巴马香猪卵巢组织HAS2、PTGS2、Ptx3、Tnfaip6以及SMAD2的mRNA表达水平,250 mg/kg组显著降低了(P<0.05) SMAD3和SMAD4的mRNA表达水平。日粮中添加不同水平的SIF减少了产仔母猪的头数,增加了返情母猪头数。结果表明：大豆异黄酮还可通过调节GDF-9/BMP-15信号通路中关键因子的表达,来干扰猪的卵泡发育,进而影响繁殖性能。(3)日粮中添加1250 mg/kg的SIF和0.66 mg/kg的EV减少了(P<0.05)巴马香猪卵巢中闭锁卵泡数目。500、1250 mg/kg添加水平的SIF显著增加了(P<0.05)巴马香猪卵巢组织Bc1-2的mRNA表达水平,250 mg/kg组降低了(P<0.05)Bax的mRNA表达水平,且随着SIF含量的增加,Bcl-2的蛋白表达水平逐渐增加,Bax的蛋白表达水平逐渐降低,提示SIF可通过调节Bcl-2和Bax的表达水平减少卵泡闭锁。(4)在体外培养的颗粒细胞的培养基中加入100、500 μM的大豆苷元和1、10、100和500州的染料木黄酮,能显著抑制(P<0.05)培养48 h时颗粒细胞的活力。大豆苷元和染料木黄酮均显著抑制了(P<0.05)颗粒细胞ERβ的mRNA表达水平,染料木黄酮还显著抑制(P<0.05)ER α的mRNA表达水平。0.1和1 μM的染料木黄酮则降低了(P<0.05)培养基中孕酮的浓度。各添加水平的大豆苷元显著降低了(P<0.05)颗粒细胞3β-HSD的mRNA表达水平,而染料木黄酮则显著降低了(P<0.05)细胞StAR和3β-HSD的mRNA表达水平。同时,在培养基中加入0.1和10 gM的大豆苷元显著降低了(P<0.05)猪颗粒细胞CYP11A1的表达水平,而1和10μM的大豆苷元则降低了(P<0.05) CYP19A1的表达水平。说明大豆苷元和染料木黄酮均能通过下调类固醇激素合成通路中关键基因的表达来影响颗粒细胞雌二醇和孕酮的合成与分泌。在体外培养的猪颗粒细胞培养基中加入0.1μM的染料木黄酮能显著增加(P<0.05)BMPR2的表达水平。大豆苷元和染料木黄酮均显著降低了(P<0.05)猪颗粒细胞Ptx3和HAS2基因的表达水平,10 μM的大豆苷元降低了(P<0.05) PTGS2的表达水平,1、10μM的大豆苷元显著降低了(P<0.05) Tnfaip6的表达水平,且染料木黄酮均显著降低了(P<0.05)颗粒细胞Tnfaip6的表达水平。说明给体外培养的猪颗粒细胞的培养基中加入不同浓度的大豆苷元和染料木黄酮,虽然不改变GDF-9/BMP-15受体的表达水平,但是能显著下调其下游调控因子的表达水平。在体外培养的猪颗粒细胞培养基中加入1、10 μM的大豆苷元减少了(P<0.05)细胞的早期凋亡率,1 μM的大豆苷元还减少了(P<0.05)细胞的晚期凋亡率和总凋亡率,0.1、1μM的大豆昔元减少了(P<0.05)死亡细胞的百分率。不同浓度的染料木黄酮减少了(P<0.05)猪颗粒细胞的早期凋亡率,但是增加了(P<0.05)晚期凋亡率、总凋亡率和死亡细胞的百分率。添加0.1μM的大豆苷元显著增加了(P<0.05)颗粒细胞Bcl-2/Bax的比例。在培养基中加入不同浓度的染料木黄酮,降低了颗粒细胞Bcl-2的表达水平,其中添加1 μM的水平达到显著性水平(P<0.05)；添加10 μM的染料木黄酮则增加了Bax的表达水平(P>0.05),说明低浓度的大豆苷元和染料木黄酮能抑制颗粒细胞的早期凋亡,而高浓度则能引起颗粒细胞凋亡甚至死亡。由以上试验结果得出,大豆异黄酮作用于巴马香猪,导致香猪初情期延迟,卵泡发育发生障碍,其机理主要为：1)大豆异黄酮能改变下丘脑、垂体、卵巢组织雌激素受体的表达水平,影响GnRH、LH、FSH及类固醇激素合成中关键因子的表达,从而影响激素的合成和分泌,引起香猪激素调节改变；2)大豆异黄酮能下调GDF-9/BMP-15信号通路中关键因子的表达,减少卵巢中各期卵泡的数量,从而影响卵泡的正常发育和香猪的繁殖性能；3)颗粒细胞的体外培养试验也表明,大豆苷元和染料木黄酮均能改变细胞雌激素受体、固醇激素合成关键基因、GDF-9下游因子的基因表达,从而影响固醇激素的合成和分泌。由此可知,大豆异黄酮作为饲料添加剂,或者后备母猪日粮配方中使用高水平的豆粕需要慎重考虑。