百里香离体培养生产次生代谢产物的研究

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百里香(Thymus vulgaris L.)为唇形科百里香属植物,又名地椒、地姜、麝香草,是一种颇具开发价值的多用途植物。百里香的花、茎、叶均可提取精油,其精油价值高,应用范围广,主要应用于食品加工、精细化工、日用化妆品以及医疗保健等领域。近年来,百里香精油的市场需求日益增大,但野生百里香资源有限,并且栽培百里香的生长周期长且有效成分含量低。因此,利用植物离体培养技术来生产百里香精油,具有特殊的理论和现实意义。本文主要采用细胞悬浮培养、诱导子添加等离体培养技术来研究百里香精油的合成,研究了百里香实生苗、种子无菌苗、组培苗精油的化学成分及抑菌活性,同时也研究了水蒸气蒸馏法、有机溶剂萃取法、CO2超临界萃取法等提取方法对精油的质量及成分的影响。主要研究结果如下:  1、茎段是诱导百里香愈伤组织和进行悬浮培养的理想外植体,愈伤组织最佳诱导培养基为MS+NAA1.0 mg/L+6-BA0.5 mg/L+2,4-D0.5 mg/L,最佳增殖培养基为MS+6-BA1.0 mg/L+2.4-D0.1 mg/L,悬浮培养适宜培养基为MS+6-BA0.5 mg/L+2.4-D0.1 mg/L。所建立的悬浮细胞系生长呈“S”型曲线,最适继代周期为18~20d,在悬浮培养过程中,培养液的pH值和电导率变化趋势均为先下降后上升最后趋于稳定,细胞数则呈现先上升后下降的趋势,悬浮细胞的精油成分主要含有百里酚、间伞花烃、松油烯、石竹烯等化学成分。  2、在不定芽增殖过程中,添加供试浓度的CH和SA都能不同程度促进不定芽的增殖,与对照处理相比,可溶性糖含量都有不同程度的降低,可溶性蛋白则有不同程度的增加,SOD、POD、PAL活性上升,PPO活性下降,其中添加300 mg/L CH和1.0 mg/L SA效果最佳,其增殖系数分别比对照显著增加51.05%、20.71%,精油含量分别达到0.38%、0.41%,比对照(0.31%)分别了增加了22.6%、32.3%,其精油的主要化学成分保持不变。  3、适宜浓度的Ple和MJ促进了百里香不定芽的增殖,提高了不定芽中可溶性蛋白含量和可溶性糖含量,增强了不定芽中SOD、POD、PAL活性,抑制了PPO活性且具有明显的浓度效应,其中添加100 mg/L Ple和150 umol/L MJ效果最佳,其增殖系数分别比对照显著增加47.03%和23.57%,精油提取率分别为0.42%、0.39%,分别比对照(0.31%)增加了35.5%、25.8%,且精油的主要化成成分保持不变。  4、水蒸气蒸馏法、有机溶剂萃取法、CO2超临界萃取法提取的百里香精油得率分别为0.21%、0.19%、0.27%。水蒸气蒸馏法提取的百里香精油的主要化学成分为百里香酚、间伞花烃、松油烯和石竹烯;有机溶剂萃取法的百里香精油的主要化学成分为1,2-苯二甲酸-单-2-乙基己基酯、百里酚、松油烯;CO2超临界萃取法的百里香精油的主要化学成分百里香酚、3-苯基-2-丙烯酸-甲酯、间伞花烃。从精油质量、精油主要化学成分以及精油得率综合比较3种方法,水蒸气蒸馏法为提取百里香精油的最佳方法。  5、百里香组培苗、种子无菌苗和实生苗中精油的主要化学成分保持不变,均含有百里香酚、对伞花烃、松油烯等;3种样品精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有明显的抑菌作用,其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用强于大肠杆菌。
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