在我国传统少数民族地区,一直以来就有自制并食用发酵奶制品(包括固体如奶酪,液体如酸奶)的习惯。在这些传统酸奶制品中,含有丰富的微生物资源。乳酸菌为主的益生菌是其中的主要组成部分。乳酸菌是指一类可以利用发酵糖产生乳酸的细菌总称,但这个名称就细菌分类而言是个非科学分类的名称。乳酸菌主要指一类革兰氏阳性菌,不产气,利用乳糖分解产生乳酸的细菌。乳酸菌大量存在于环境中,具有包括提高免疫力、抗癌等多种益生功效。本文主要以采自西藏民间自制液体酸奶和新疆自制固体奶酪为实验材料,利用传统培养方法与非培养方法对其中的益生菌进行研究,明确这些地区自制传统奶制品中乳酸菌多样性及相关内容。1.从西藏、新疆采集传统奶制品样品20份,利用传统分离培养的方法,选择MRS、BCP培养基对样品进行稀释分离培养。BCP作为乳酸菌专用培养基,当乳酸菌在BCP培养基上生长时,培养基会由蓝紫色转化为黄色,以黄色区域作为乳酸菌生长状态的观察,具有便利与准确性。通过分离培养得到菌株102株,并对其进行革兰氏染色,均为革兰氏阳性菌,在显微镜下观察其形态学。同时进行过氧化氢酶检测,除13株外均为阳性；10%脱脂奶检测,均凝固；2.采用CTAB法小量提取菌株基因组DNA,并利用引物341F/534R对16S V3可变区进行扩增,将实验结果用于PCR-SSCP分析,根据主条带的不同对菌株进行分类。根据PCR-SSCP实验结果,每个样品中分离得到的菌株可根据主带型不同可分为1-3类,选取其中不同的类型进行后续实验确定菌株属种。3.对不同的菌株进行API50/API20测定,得到其具体属种信息。以相似性大于80%为标准,鉴定到具体属种。对不能以此鉴定的菌株,利用27F/495R引物PCR扩增后进行测序,综合鉴定,确定其属种。根据分离到的种类和频率,进行乳酸菌的多样性分析,结果得到样品中乳酸菌的多样性表现在属内,主要为乳杆菌属中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)以及弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)和德氏乳杆菌(Lactobacillus delrueckii)。4.通过PCR-DGGE非培养方法,利用珠打法直接提取样品中乳酸菌的总DNA，选择27F/1495R 16S rDNA进行扩增后,再选择带有GC环的引物338F-GC和534R进行巢式PCR。利用产物进行PCR-DGGE实验,得到每个泳道中含有的清晰可用于分析的条带数为8-20个,根据DGGE实验原理说明在样品内乳酸菌的种数远远大于利用传统方法得到的种类。5.利用软件Quantity One和SPSS对DGGE图谱进行分析。利用Shannon指数分析各个样品中乳酸菌的多样性。多样性指数结果表明样品18在乳酸菌组成的多样性最高,说明其中乳酸菌种类最多,含量均匀度也最高。采用UPGMA法用Person系数对样品间的相似性进行比较,并进行聚类分析。结果表明样品16具有最低的相似性,其与样品18聚类后,具有与其他样品最远的距离,表明在乳酸菌组成、含量方面与其余样品差别比较明显。通过对比样品信息、,发现二者为新疆地区样品,说明不同地区由于自然环境等地理条件的不同,样品中乳酸菌多样性也有较大区别。6.对比培养方法与非培养方法的实验结果,利用培养方法分析得到样品中乳酸菌种类最多的样品13,为3种,但均为乳杆菌,其余样品中分离得到的乳酸菌多为1-2种。而利用非培养方法得到的DGGE图谱中至少含有8条清晰条带,根据实验原理可以说明其中至少含有8个种类的乳酸菌,样品中乳酸菌多样性明显高于培养方法。说明非培养方法可以检测到难以培养或未可培养的更多属种的乳酸菌。因此,将培养与非培养方法相结合,才能得到正确完整的实验结果。