1.研究背景肾细胞癌占所有癌症比例的2%至3%,大约30%的患者在诊断时已经出现转移,其余经过手术切除的患者有30%到40%会在随访过程中出现转移。肾透明细胞癌是肾细胞癌最常见类型,约占肾癌总数的75%。近年来,针对血管内皮生长因子受体的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的出现,大大改善了转移性肾细胞癌的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）,已成为转移性肾癌的一线治疗策略。苹果酸舒尼替尼是一种用于治疗晚期或转移性肾细胞癌的口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂,其对包括包括血管内皮生长因子受体（VEGFR）1、2、3,血小板衍生生长因子受体（PDGFR）α、β,和碱性成纤维细胞因子（bFGF）在内的等多个酪氨酸激酶受体（TKRs）活性具有抑制作用。舒尼替尼通过抑制上述TKRs发挥抗血管生成作用,阻断肿瘤生长所需的营养物质供给,同时还能够直接杀死肿瘤细胞,从而起到抗肿瘤作用。但是,大多数转移性肾癌患者都会迅速出现对酪氨酸激酶抑制剂的耐药,而且在停药后并没有观察到较长的无进展生存期。近年来出现的免疫检查点抑制剂（ICI）,如程序性死亡受体1（PD-1）抑制剂、程序性死亡受体配体1（PD-L1）抑制剂和细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）抑制剂已被FDA批准用于十几个不同的实体肿瘤,包括皮肤、肺、肾、膀胱、头颈部、淋巴细胞、肝和胃癌等,这也为转移性肾癌的治疗带来了新的曙光。然而,基于三期临床试验数据,PD-1/PD-L1抑制剂的临床反应率作为单一疗法使用时仅有20-44%。因此,TKI和ICI的新组合正成为一种新的治疗策略选择。近期进行的二期/三期临床试验也显示,TKI和ICI联合治疗取得较单药治疗更高的客观缓解率和无进展生存期。然而,TKI和ICI的联合治疗的分子机制尚需要进一步的研究。MiT/TFE（microphthalmia-associated transcription factor,小眼畸形转录因子）家族蛋白是进化上高度保守的一类转录调控因子,由包括TFEB、TFE3、TFEC和MITF在内的一系列碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链（bHLH-LZ）转录因子组成,在溶酶体生物发生、细胞能量稳态和免疫反应等方面发挥着重要的调节作用,并广泛参与肿瘤的发生发展,被看作是一种原癌基因。TFEB及TFE3在肾癌、黑色素瘤、肺泡肉瘤中都存在异常表达的情况,且与患者预后成明显的负相关性。TFEB或TFE3基因融合易位型肾癌相比于透明细胞癌患者,其复发和转移率较高,预后明显较差。研究发现在MiT/TFE家族易位型肾细胞癌中,PD-L1在90%的肿瘤浸润性免疫细胞中呈过表达,明显高于其他类型肾细胞癌。这些结果表明MiT-TFE家族不仅在肾癌的进展中起着重要的作用,而且在肿瘤免疫逃逸的产生中也起着重要的作用。TFE3和TFEB在营养感应和能量稳态中发挥重要作用,在营养丰富的条件下,TFEB和TFE3定位在胞质中。在细胞缺氧或饥饿状态下,TFEB及TFE3去磷酸化并迅速转移至细胞核内从而被激活。我们推测舒尼替尼通过抗血管生成作用导致肿瘤组织缺氧、营养缺乏,可激活TFE3和TFEB,进而上调PD-L1表达,从而介导肾癌免疫逃逸,这可能是舒尼替尼耐药的潜在机制之一,也为舒尼替尼和PD-L1抑制剂联合治疗提供了理论支持。目前,关于TFE3和TFEB在促进肾癌增殖及诱导肾癌免疫逃逸中的机制尚无深入研究。本课题我们拟研究:舒尼替尼激活TFE3进而上调PD-L1表达,从而介导ccRCC免疫逃逸的具体机制,并探索针对本机制新的治疗方法。2.研究目的研究TFE3促进ccRCC细胞增殖的机制;研究TFE3通过上调PD-L1的表达进而介导ccRCC细胞免疫逃逸的机制;研究舒尼替尼通过激活ccRCC细胞TFE3进而增强PD-L1表达的机制;建立小鼠肾癌移植瘤模型,研究舒尼替尼联合PD-L1抑制剂对小鼠肾癌的治疗效果。3.实验方法3.1 TFE3促进ccRCC细胞增殖的机制研究通过分析Kaplan Meier绘图仪数据库,研究TFE3和TFEB表达与ccRCC患者生存预后的关系;通过分析癌症基因组图谱数据库（TCGA）和癌细胞系百科全书数据库（CCLE）,研究TFE3和TFEB在ccRCC组织标本和肿瘤细胞系中的表达差异,并通过qPCR进一步验证TFE3和TFEB在ccRCC组织标本的表达差异;采用siRNA瞬时转染法构建TFE3和TFEB基因敲减786-O细胞,qPCR和Western Blot检测敲减效率,分别采用XCelligeligence RTCADP仪、细胞形态学观察、EdU染色及克隆形成实验检测TFE3和TFEB基因敲减后对786-O细胞增殖的影响。3.2 TFE3诱导PD-L1表达上调进而介导ccRCC细胞免疫逃逸的机制研究qPCR 检测 786-O 细胞 TFE3 和 TFEB 基因敲减后,CD273（PD-L2）、CD274（PD-L1）及CD275（ICOSL）等免疫检查点标记物的表达;qPCR检测A498、TK-10、HepG2细胞TFE3和TFEB基因敲减后PD-L1水平的表达;采用Western Blot、免疫荧光及流式细胞术检测786-O细胞TFE3和TFEB基因敲减后PD-L1的表达水平;通过荧光素酶报告实验检测TFE3和TFEB过表达后对PD-L1表达的影响;通过癌细胞系百科全书（CCLE）数据库,分析ccRCC肿瘤细胞系中TFE3和TFEB与PD-L1表达的相关性;通过HE和免疫组化染色检测ccRCC病理标本中PD-L1和TFE3表达的相关性,并检测免疫组化染色PD-L1低表达区及高表达区TFE3的核强度的差异,通过Western Blot检测ccRCC组织标本中TFE3和PD-L1蛋白表达水平的关系。3.3舒尼替尼通过激活ccRCC细胞TFE3进而上调PD-L1表达的机制研究将肾癌细胞系（786-O,A498,TK-10）分为实验组及对照组,实验组加入舒尼替尼（5μM）,处理48h后,qPCR及Western Blot检测各组PD-D-L1 RNA及蛋白的表达;流式细胞术检测在舒尼替尼作用下786-O细胞PD-L1的表达;Western Blot检测在舒尼替尼作用下786-O细胞TFE3核转位的表现,并采用免疫荧光法检测TFE3在细胞核及胞浆组分中的分布情况;在TFE3基因敲减786-O细胞中,通过qPCR及流式细胞术检测实验组及对照组PD-L1的表达水平;构建TFE3过表达786-O细胞,qPCR检测实验组及对照组PD-L1的表达水平。3.4舒尼替尼联合PD-L1抑制剂对肾癌小鼠皮下移植瘤模型治疗效果的研究建立肾癌Renca细胞小鼠皮下移植瘤模型。将40只小鼠右上肢外侧皮下接种小鼠肾癌Renca细胞,并随机分为8组,其中4组接受药物处理后处死,另外4组接受药物处理后继续饲养至自然死亡。药物处理分组:舒尼替尼组、PD-L1抑制剂组,舒尼替尼+PD-L1抑制剂组及赋形剂+IgG对照组。当肿瘤生长至50mm3时,给予药物舒尼替尼（40mg/kg,i.p.）及PD-L1抑制剂（200ug/小鼠,i.p.）,每2天一次,共5次,第5次注射2天后,处死小鼠,剥取移植瘤。每次给药前及处死前测量小鼠体重及肿瘤体积,绘制生长曲线。qPCR检测各组肿瘤组织中TFE3及PD-L1的表达水平。制备移植瘤单细胞悬液,并纯化分离肿瘤浸润淋巴细胞,流式细胞仪检测各组CD8+细胞毒T细胞颗粒酶B（GZMB）表达的差异。非处死组继续饲养至自然死亡,记录小鼠生存时间。3.5统计分析使用Image Pro Plus 6.0对Western Blot和荧光图像进行分析。数据以平均值±标准差表示,并使用GraphPad Prism软件进行统计分析（GraphPad）。根据数据资料的类型选择相应的统计学分析方法,计数资料选用Fisher精确检验或卡方检验,计量资料选用t检验或方差分析。采用Kaplan-Meier和Log-rank进行生存分析,采用Cox比例危险模型分析评估预后因素的意义。所有实验至少重复三次。p<0.05为有统计学意义,图中表示为*p<0.05,**p<0.01,,***p<0.001。4.实验结果4.1 TFE3可显著促进ccRCC细胞增殖,而TFEB对细胞增殖无明显影响为阐明TFE3和TFEB在ccRCC中的作用,我们首先分析了公开发表的关于TFEB和TFE3表达的Kaplp1an Meier绘图仪数据库,结果显示,TFE3表达与ccRCC患者的生存期呈负相关,而TFEB无明显负相关。我们通过分析TCGA数据集和癌细胞系百科全书（CCLE）数据集还发现,在ccRCC标本和肿瘤细胞系中TFE3基础表达高于TFEB。为进一步验证数据库信息,我们用qPCR检测了 30例ccRCC患者组织标本,结果证实TFE3表达显著高于TFEB。为确定这种差异是否决定了 ccRCC的增殖优势,我们将786-O细胞的TFEB和TFE3基因敲减,结果显示TFEB敲减不影响细胞增殖,TFE3的敲减显著抑制了细胞的增殖。这些结果通过EdU染色和克隆形成实验进一步得到验证。此外,我们还在肝癌细胞中将TFEB和TFE3基因敲减,并得到相似的结果。这表明在肾癌等恶性肿瘤中,TFE3可发挥强有效的促肿瘤增殖作用。4.2在ccRCC细胞系和患者中,TFE3可通过上调PD-L1的表达而介导免疫逃逸我们接下来研究TFE3和TFEB是否可以通过调节免疫检查点分子的表达来介导免疫逃逸。结果显示,TFE3和TFEB均可正向调控CD274（PD-L1）、CD273（PD-L2）和CD275（ICOSL）等免疫检查点分子的表达。为了进一步阐明TFE3和TFEB对PD-L1表达的调控,我们首先将多个肿瘤细胞系（ccRCC细胞（786-P、A498、TK-10）、肝脏腺癌细胞（HepG2））的TFE3和TFEB基因敲减,发现PD-L1也随之下调。Western Blot、免疫荧光和流式细胞术进一步证实上述结果。我们通过双荧光素酶报告实验,将TFE3和TFEB过表达质粒分别与荧光素酶报告质粒共转染,发现TFE3和TFEB过表达后均可显著增加pGL3-PD-L1报告质粒的荧光素酶活性,这说明TFE3和TFEB可以明显增强PD-L1基因启动子活性,进而上调PD-L1的表达。我们通过CCLE公用数据库获取ccRCC肿瘤细胞系数据资料,分析发现ccRCC肿瘤细胞系中TFE3表达水平与PD-L1水平呈正相关,而TFEB与PD-L1水平无明显相关性,这提示TFE3可能比TFEB对PD-L1的调控更为明显,因此,在后续实验中,我们重点研究TFE3在ccRCC免疫逃逸中的机制。接下来,我们评估在ccRCC组织标本中,TFE3水平是否与PD-L1表达具有相关性。免疫组化显示PD-L1高表达区域可发现TFE3高表达和核定位增强,Western Blot也进一步证实ccRCC组织中TFE3与PD-L1表达水平呈正相关。4.3舒尼替尼通过激活ccRCC细胞TFE3进而诱导PD-L1表达上调qPCR和Western Blot检测发现在不同ccRCC细胞系中舒尼替尼均可以诱导PD-L1的表达上调。流式细胞术检测也证实了上述结果。接下来我们进一步检测了舒尼替尼上调PD-L1的表达是否依赖于TFE3的激活,而TFE3激活依赖于其入核。核浆分离实验和免疫荧光实验结果显示,舒尼替尼显著增强786-O细胞中TFE3核转位及表达。敲减TFE3可以抑制PD-L1的表达,并且能够部分抵消舒尼替尼诱导的PD-L1水平上调。相反,TFE3过表达可增强PD-L1的表达,并可进一步增强舒尼替尼诱导的PD-L1表达。这些结果表明,舒尼替尼通过激活ccRCC细胞TFE3来诱导PD-L1的表达上调。4.4联合PD-L1抑制剂治疗可显著增强舒尼替尼对小鼠肾癌移植瘤的抗肿瘤效果我们构建了肾癌小鼠移植瘤模型,与对照组比较,单独给予PD-L1抑制剂治疗或单独给予舒尼替尼均可以显著降低肿瘤大小。但联合使用舒尼替尼和PD-L1抑制剂治疗组的肿瘤体积减小最为显著。我们采用qPCR检测了各组肿瘤组织中TFE3及PD-L1表达水平,发现舒尼替尼组及联合治疗组的TFE3及PD-L1表达水平均显著升高,证实了舒尼替尼对TFE3和PD-L1的激活及诱导。接下来,我们检测了舒尼替尼和PD-L1抑制剂对肿瘤浸润CD8+T细胞（CTL）的细胞毒性的影响,发现舒尼替尼可抑制CD8+T细胞中GZMB的表达,但联合PD-L1抑制剂后,可逆转舒尼替尼对GZMB的抑制作用,说明联用PD-L1抑制剂可解除舒尼替尼对CD8+T细胞的免疫抑制,增强CD8+T细胞介导的免疫杀伤作用。联合治疗还显著延长了小鼠的生存期。5.实验结论（1）TFE3在ccRCC组织标本和肿瘤细胞系中的表达高于TFEB,且与患者的生存率呈负相关。TFE3可显著促进ccRCC细胞的增殖,而TFEB无明显促进作用。（2）在ccRCC细胞系中,TFE3可上调PD-L1等免疫检查点分子的表达而介导免疫逃逸。在ccRCC患者中,TFE3与PD-L1表达水平也具有显著正相关性。TFE3通过增强PD-L1启动子活性进而上调其表达水平。（3）舒尼替尼可以通过激活TFE3从而诱导PD-L1在ccRCC细胞系中的表达。舒尼替尼可显著增强ccRCC细胞中TFE3核转位及表达,敲减TFE3可以显著抑制舒尼替尼诱导的PD-L1表达,而过表达TFE3可显著增强舒尼替尼诱导的PD-L1表达。（4）单一舒尼替尼或PD-L1抑制剂治疗均可以明显降低小鼠肾癌移植瘤模型肿瘤大小,但舒尼替尼联合PD-L1抑制剂治疗对肿瘤体积抑制更为显著,可显著增加小鼠存活率,并能逆转舒尼替尼对细胞毒T细胞的细胞毒性抑制作用。