高致病性禽流感病毒H5N1的爆发不仅给全世界养禽业造成了毁灭性打击,也严重危害到人类的生命安全,开发一种安全有效且广谱的疫苗是控制禽流感病毒传播的最有效的手段。毕赤酵母具有分子遗传操作简单、外源蛋白表达水平高、具有近似于哺乳动物细胞翻译后修饰与加工的功能,并且能进行高密度发酵。本研究利用毕赤酵母表达系统高效分泌表达了重组HA1蛋白,通过多种实验证明rHA1具有开发成H5N1禽流感广谱疫苗的可能性,在分子对接表位预测的基础上,鉴定了HA1上几个重要的中和表位的关键氨基酸,培养出了13D4-rHA1复合物晶体,为阐明H5N1病毒的保守中和抗体表位结构奠定了良好的基础。首先,将构建好的表达载体pPIC9K-HA1电转化进入毕赤酵母菌株GS115中,构建工程菌株,进行分泌表达。用G418筛选不同拷贝数的重组菌株,考察基因剂量对重组HA1蛋白表达的影响,实验证明适量提高拷贝数有利于提高rHA1的分泌表达量。优化了重组菌株的摇瓶培养条件,得到最佳诱导条件:初始pH值为5.4,甲醇浓度为1.0%,培养温度为25℃。在摇瓶培养的基础上,用10L发酵罐进行高密度发酵的工艺研究,发酵最终菌体浓度OD₆₀₀约为320,rHA1的表达量为120mg/L比摇瓶培养提高了10倍左右,表明我们建立起了高效稳定的高密度发酵。缺失HA1N-端前48个氨基酸残基后,rHA1的表达量提高了～5倍（～550mg/L）,且保留了与代表性中和抗体的反应性,以及与HA1相当的免疫原性。发酵培养液上清通过切向流浓缩、更换缓冲液后,利用离子交换层析柱纯化,获得了较高纯度的重组HA1蛋白,蛋白回收率为24%左右。其次,利用本实验室已经筛选到的93株H5N1禽流感病毒单抗盘进行活性检测,结果显示重组蛋白HA1具有良好的抗原性。用重组HA1和HA1-48aa蛋白免疫小鼠5周后,anti-rHA1抗体滴度达到1.2×10⁴和1.3×10⁴,并具有较好的血凝抑制（HI）活性。体外阻断实验表明小鼠血清能较好地阻断13D4、8H5、8G9、10F7等广谱中和单抗与YU22病毒的结合,说明rHA1具备开发成H5N1禽流感的广谱疫苗的潜力。在本实验已有的广谱中和表位分子对接预测的工作基础上进一步应用突变分析方法进行实验验证。结果显示,Glu¹¹²,Lys¹¹³,Ile¹¹⁴对HA1上的构象表位的维持较为重要;Pro¹¹⁸和Tyr¹³⁷是1A6和13H8构象表位的关键氨基酸;Asn¹⁶⁵的突变可使广谱中和单抗13D4的结合活性下降40倍左右,但对其他广谱中和单抗的活性无显著的影响;aa123～aa132 loop区对HA1的构象活性很重要。最后,获得rHA1与广谱性中和单抗13D4Fab复合物的晶体培养条件,培养出可用于X-射线晶体衍射实验的体积约为0.2mm×0.2mm×0.05mm的方块状晶体,为HA1-13D4复合物空间结构的解析奠定了基础。