萜类是天然产物中重要类群,在生物体内发挥着重要生理功能或生物活性,如抗疟疾的青蒿素,抗乳腺癌的紫杉醇,抗氧化的番茄红素,天然名贵香料檀香油等。这些高价值的萜类化合物很多来自植物,但是从植物组织细胞中直接提取则费时耗力,化学直接合成则成本高昂。随着这些天然产物合成途径的解析,当前基于微生物的代谢工程手段给予了生产这些活性萜类天然产物的新策略,通过选用安全可靠的宿主微生物,导入目标化合物合成的特异性基因,甚至重新引入或改造整条代谢通路,优化特殊酶的表达系统并结合多种代谢工程手段,在诸如酿酒酵母体内合成目标天然产物,这种利用微生物来合成天然产物的手段比直接提取要高效节能。本研究选择高价值的抗氧化剂和着色剂番茄红素与名贵香料檀香油主成分前体物a-檀香烯作为目标化合物做高产研究。1、基于链霉菌底盘的番茄红素高产研究(1)宿主底盘Streptomyces avermitilis的选择。番茄红素高产研究多基于大肠杆菌和酵母底盘,但目前研究者在经过大量操作后,产量的提升空间已经十分有限,本研究首次选用次级代谢产物丰富多样的链霉菌作为底盘,挑选拥有大量萜类次级代谢产物基因簇的阿维链霉菌Streptomyces avermitilis作为宿主。(2)番茄红素合成基因簇的选择。通过S. avermitilis的基因组分析,发现其编码的萜类基因簇中蕴含有一个沉默的番茄红素合成的基因簇。本研究选取这个沉默的番茄红素基因簇,作为表达番茄红素的合成基因,通过过表达这一基因簇,成功实现这一基因簇的激活,得到番茄红素。(3)启动子元件选择。基因的表达与启动子关系密切,在链霉菌系统中,本实验室前期通过建立基于流式细胞仪的荧光定量技术表征了系列的表达元件,研究中从启动子元件库中选择了系列启动子,通过Gibson assembly和Golden Gate技术构建7种不同启动子元件驱动的番茄红素基因表达单元,利用整合型质粒将表达单元整合到宿主基因组中,通过优化发酵条件,发酵检测。结果显示,随着启动子强度的逐渐增强,番茄红素的产量呈现先高后低的产量变化,此时番茄红素的产量在SP23启动子驱动下5天达到13.88 mg/g DCW水平。(4)绝缘子元件的引入。随着启动子强度的逐渐增强,番茄红素产量呈现先高后低的变化,这一现象可能是由于表达元件之间相互干扰所致,前人的研究中得知一类绝缘子元件可以有效的减弱表达元件之间的干扰,研究中在系列启动子和crtE基因RBS之间引入绝缘子元件RiboJ,有效的消除了表达元件之间的干扰,随着启动子的强度增强,菌株的番茄红素的产量也逐步增加,番茄红素在SP44启动子的表达下获得了82.02±8.69 mg/g DCW的产量,其菌株单产优于大肠杆菌的现有水平。2、基于酿酒酵母底盘的α-santalene高产研究(1) Saccharomyces cerevisiae底盘的选择。由于α-santalol的合成途径中涉及植物来源的真核系统依赖的CYP450依赖的单加氧酶和还原伴侣蛋白,研究选择真核模式生物酵母菌为出发菌株,初步选择烯烃代谢优势酵母Yarrowia lipolytica,和改造实例丰富的S. cerevisiae。在对比菌株初始产量、产物比例和遗传操作工具的前提下,选择S.cerevisiae作为宿主菌株。(2)过表达tHMG1和ERG20。为了验证MVA途径操作对增产的作用,研究中先采用GAL1-10p诱导型启动子体系(后期可以通过敲除GAL80,实现自诱导。)过表达MVA途径的最重要的限速靶点截断型HMG-CoA还原酶基因tHMG1和FPP合酶基因ERG20,并导入檀香烯合酶基因SaSSy,检测到α-santalene的产量提升约7倍；(3)底盘细胞代谢工程改造。上述操作有效后,采用MVA途径全途径过表达,其中tHMG1做三重过表达,对FPP的代谢点做限流优化：首先,使用MET3p替换利用FPP合成甾醇的ERG9基因自身启动子,MET3p在外源添加甲硫氨酸时受到抑制；其次,敲除DPP1和LPP1这两个利用FPP转化为FOH的酶,实现对FPP代谢支路的抑制,在研究初期,使用GAL1-10p的半乳糖诱导体系,为增强诱导效果,敲除半乳糖代谢基因GAL1, GAL10和GAL7。外源基因的表达前期使用低拷贝的游离型质粒,后期采用高拷贝游离型质粒。通过上述操作,α-santalene的产量再度提升约15倍,通过最终定量,α-santalene的产量在摇瓶水平,利用合成培养基,3天的产量达到182 mg/L。在使用经密码子优化后的SanSyn基因替换SaSSy后,工程菌株BY4742-MVA-426-SanSyn的α-santalene产量为404.74±12 mg/L,为后续的α-santalol的生产提供了坚实基础。本研究所选择的链霉菌底盘可以为很多萜类的微生物合成提供新的思路和底盘选择；酿酒酵母中合成α-santalene的工作中构建的底盘,可以为同为倍半萜化合物的高产提供普适性的宿主和研究策略。