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第一章：A20基因表达载体的构建、质粒的提取及体外鉴定目的：1、构建一种携带A20基因的表达载体。2、培养大肠杆菌,提取高浓度、高纯度的质粒DNA。3、质粒DNA的体外鉴定。方法：1、构建成A20的基因表达载体pcDNA3.1-A20,并将带有目的基因的质粒转化到感受态大肠杆菌中,用空质粒载体pcDNA3.1作为对照,-20℃保存备用。2、大肠杆菌采用固体LB培养基划盘,37℃恒温培养箱培养12-16h,挑取单菌落,接种于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中,置37℃恒温摇床,转速210r/min,培养12-16h,提取质粒DNA,测定其浓度,并对其进行1%琼脂糖凝胶电泳,以确定是目的基因。3、重组质粒DNA经过体外细胞转染,荧光倒置显微镜观察细胞转染的表达情况。结果：1、经过酶切、提取、电泳鉴定后结果完全正确。2、体外转染HK-2细胞,有绿色荧光表达的细胞为转染细胞。结论：体外实验证实A20基因表达载体可有效转染HK-2细胞。第二章：银杏叶提取物与转基因诱导A20过表达在大鼠肾脏缺血再灌注损伤中的作用目的：1、建立一种稳定、可靠的大鼠肾缺血再灌注损伤模型。2、观察银杏叶提取物及转基因方法诱导A20过表达对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的作用,为临床防治肾IRJ提供实验性理论依据。方法：1、雄性SD大鼠,体重250-280g,用50mg/kg体重戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉,打开腹腔,分离左肾动脉和静脉,微型血管夹夹闭左肾动静脉45min,夹闭期间行右肾切除术。45min后松开血管夹,观察大鼠左侧。肾脏血管再灌注情况并缝合腹部切口。制成大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型。2、技术熟练后,行大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型制作。实验大鼠随机分四组：分别为生理盐水组、A20组、银杏叶组、A20+银杏叶组,每组8只大鼠。术前48小时对生理盐水组、A20组、A20+银杏叶组,分别通过尾静脉注射生理盐水、脂质体pcDNA3.1-A20+生理盐水250μl(15μl脂质体加10μg构建的质粒DNA混匀后加入生理盐水至250μ1),银杏叶组和A20+银杏叶组于术前30min腹腔注射银杏叶提取物50mg/kg。手术后24h收获大鼠,分别由下腔静脉采血5ml,取左侧肾脏,肾脏组织分三部分,1/3置于10%中性福尔马林缓冲液中固定,待作组织学检查,另2/3组织分两部分,速冻于液氮并转存于-80℃冰箱保存,行相关检测。血清采用全自动生化分析仪检测Scr.BUN,肾组织HE染色行病理学检测,TUNEL法检测肾小管上皮细胞的凋亡情况,Western blot法检测A20蛋白的表达,RT-PCR检测A20mRNA水平的表达,EMSA检测NF-kB的活性。结果：1、经过练习,建立了比较稳定的大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型。手术成功率可达95%。2、A20组和A20+银杏叶组血清Scr、BUN水平明显低于其余各组,差异有统计学意义(p<0.05)。A20+银杏叶组与A20组比较,差异有统计学意义；各组肾小管都有不同程度的损伤,银杏叶组、A20+银杏叶组以肾小管上皮细胞刷状缘损伤为主,与生理盐水组比较,肾组织病理损伤明显减轻(p均<0.05)。A20组与生理盐水组比较,肾小管扩张,肾小管上皮细胞刷状缘脱落、坏死,蛋白管型等肾脏组织病理损伤减轻,差异有统计学意义(P<0.05)；肾小管上皮细胞凋亡多见于远端小管,与生理盐水组比较,各组凋亡细胞数均明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);银杏叶组和A20+银杏叶组与A20组比较,凋亡细胞数明显减少(P均<0.05)；各组A20蛋白及mRNA水平表达均有所升高,与生理盐水组比较,A20组与A20+银杏叶组升高更明显,差异有统计学意义(p均<0.05)；各组NF-kB的活性均不同程度受抑制,与生理盐水组比较,A20组与A20+银杏叶组中,NF-kB活性受抑制更明显。结论：银杏叶提取物与转基因方法均能上调A20基因在体内的表达,改善肾功能,减轻肾IRI的病理损害及肾小管上皮细胞凋亡,从而达到肾脏保护作用,且二者合用效果较为突出,其机制可能与A20抑制肾小管上皮细胞凋亡,通过负反馈抑制NF-kB信号传导通路发挥作用有关。