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本研究小组前期研究发现杨树菇(Agrocybe aegerita)的蛋白质组分具有抗肿瘤活性,对其中抗肿瘤活性蛋白AAL (Agrocybe aegerita lectin,杨树菇凝集素)进行了分离纯化,基因克隆,晶体结构分析,发现抗肿瘤活性与糖结合活性相关,本论文继续探讨了rAAL (recombinant AAL,重组AAL)的抗肿瘤活性与细胞表面相关抗原的糖基化之问的关系；并分离纯化了一种新的抗肿瘤蛋白AAD (Agrocybe aegerita Deoxyribonuclease,杨树菇DNase)。第一部分：rAAL抗肿瘤活性与细胞表面抗原糖基化的关系细胞表面糖蛋白和糖脂的糖基化改变是肿瘤特征之一,这些异常的糖基化修饰能够促进肿瘤发生和肿瘤细胞迁移。而肿瘤中糖链的异化经常是由O-聚糖合成的不完全所导致,如sulfo-TF antigene ([3OSO3]-Gal β1-3GalNAcα-Ser/Thr)就是肿瘤相关抗原中的一种,它在许多肿瘤中都高表达,可以作为肿瘤治疗靶标分子。AAL (Agrocybe aegerita lectin)是从杨树菇中纯化的一个抗肿瘤凝集素,具有很强的抗肿瘤活性。本论文用糖芯片方法(美国CFG中心检测)检测了rAAL的糖基结合特性,结果显示rAAL与硫酸化糖基的亲和力最高(其中与肿瘤抗原sulfo-TF二糖的亲和力排名第一),其次是唾液酸化糖基。我们检测了AAL (?)寸6种肿瘤细胞系的抑制能力,结果显示rAAL对亲和力越高的肿瘤细胞杀伤活性越强,通过Caspase依赖的凋亡通路抑制肿瘤生长。用定量PCR分析肿瘤细胞中TF抗原合成途径中相关的6种糖基转移酶(?)RNA表达水平,发现肿瘤细胞中糖基转移酶GAL3ST2/ST3GAL1的比值与rAAL杀伤肿瘤细胞呈正相关(R=0.7807)。通过建立过表达ST3GAL1稳定细胞系ST3GAL1/Jurkat,,降低GAL3ST2/ST3GAL1的比值,可以降低细胞对rAAL的亲和力和敏感性。建立过表达GAL3ST2的稳定细胞系GAL3ST2/HL60和GAL3ST2/HeLa细胞,增高GAL3ST2/ST3GAL1的比值,则能增强细胞对rAAL的亲和力和敏感性。用O-糖链延伸的抑制剂Benzyl-α-GalNAc处理Jurkat细胞后,也能降低细胞对rAAL敏感性。因此本部分研究证明AAL亲和力最高的配体是肿瘤抗原——sulfo-TF抗原,且决定sulfo-TF含量的糖基转移酶GAL3ST2/ST3GAL1(?)匕例与细胞对rAAL的敏感程度呈正相关,说明sulfo-TF是AAL抗肿瘤活性的重要生理靶标之一,从而为rAAL进一步用于sulfo-TF抗原研究和高表达sulfo-TF抗原肿瘤的诊断、靶向治疗提供了理论依据。第二部分：一种新的杨树菇DNase (Agrocybe aegerita Deoxyribonuclease, AAD)的分离、纯化、性质分析及抗肿瘤活性研究我们以前的研究表明大型药用真菌的蛋白质成分有很强的抗肿瘤活性,大型药用真菌中已经分离纯化出多种抗肿瘤蛋白质,包括类泛素蛋白(ubiquitin-like protein),核糖体失活蛋白(Ribosome-inactivating Proteins)和凝集素(lectin)。杨树菇(Agrocybe aegerita)子实体中蛋白质含量约占干重的25%-30%,且蛋白质组分有很好的抗肿瘤效果,我们已经从中分离纯化出两种抗肿瘤凝集素AAL和AAL-2。到目前为止,已有多种脱氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease, DNase)从真菌中被分离纯化,但没有具有抗肿瘤活性的报道。脱氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease, DNase)是一类能切割DNA双链的蛋白质,其参与了细胞程序性死亡,其中Deoxyribonuclease I (DNase I)被作为抗肿瘤候选药物之一。本部分研究中我们从杨树菇子实体蛋白质组分中分离纯化出一个新的抗肿瘤蛋白AAD (Agrocybe aegerita DNase)。细胞实验证明AAD通过Caspase通路诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞生长。AAD的DNase酶活特性说明AAD属于DNase I家族。其蛋白质串联质谱检测结果表明AAD的氨基酸序列和Agrocybe aegerita Aa-Pril的氨基酸序列有97%的同源性。