论文部分内容阅读
目的:1.采用流式细胞仪分析BxPC-3、SW1990和Panc-1胰腺癌细胞株中表面抗体CD24CD44阳性细胞的阳性率,并对阳性表达率最高一组的胰腺癌细胞株进行分选,为后续实验做准备;2.携带影响Smo基因的载体慢病毒的构建及转染,对胰腺癌细胞表面抗体CD24CD44阳性细胞感染及检测其感染性;3.分析慢病毒感染胰腺癌细胞表面抗体CD24CD44阳性细胞后的Hh信号通路表达,细胞生物学特性检测。方法:1.应用流式细胞仪分析3个胰腺癌细胞株中表面抗体CD24CD44阳性细胞的阳性率后选择阳性率最高一组,并分选出表面抗体CD24CD44阳性细胞为研究对象进行后续相关实验;2.设计与合成携带特异性Smo片段的慢病毒并检测其功能性,分别为过表达组及抑制组,阴性对照组,用于后续实验研究对比;3.携带Smo载体慢病毒感染目的细胞后,用RT-PCR和Western blot法检测Hedgehog信号通路成员RNA和蛋白表达,及细胞生物学特性检测。结果:1.分析BxPC-3、SW1990和Panc-1胰腺癌细胞株中CD24CD44阳性细胞的阳性率分别:BxPC-3:11.75±1.6264%,Panc-1:28.05±2.4749%,SW1990:57.70±2.2627%。SW1990胰腺癌细胞系阳性率最高。2.成功设计制作病毒,病毒量1X106 TU,添加polybrene稀释液培养孔的细胞生长及荧光效果最佳,为后续实验感染条件和感染参数。经Western Blot检测:该质粒用flag抗体检测到250kD存在特异性条带偏大,膜蛋白过表达成功,经RT-PCR检测病毒感染后五组细胞中Smo的表达结果:空白组:1.0038±0.0344、CON238阴性组:1.0276±0.2944d、CON077阴组:0.8793±0.0402;LV-SMO15570-2过表达组:2.7479±0.8308及LV-SMO-RNAi37304-1抑制组:0.2386±0.0481;过表达组、抑制组与各组之间有差异,方差齐性:Bartlertt F=4.3530.P=0.0016<0.05方差不齐,K-W检验:X2=10.9905*P=0.0267有差异;设计病毒达到目的要求。3.携带特异性Smo载体慢病毒感染SW1990CD24+CD44+细胞后。RT-PCR检测五组实验胰腺癌细胞Hedgehog信号通路成员Shh、Smo、Ptch1、Gli1、Gli2、及Bcl2,通路成员Shh、Gli2及Bcl2在各组之间对比表达未见明显差异,（P>0.05无统计学意义）;通路成员Smo在五组之间对比表达量,在LV-SMO15570-2过表达组中升高到2.7479±0.8308,在SMO-RNAi37304-1抑制组中减少到0.2386±0.0481,接近1/4。通路成员Gli1在五组之间对比SMO-RNAi37304-1抑制组中有统计学意义减少到0.4126±0.036,近1/2。（P<0.05有统计学意义）,通路成员Gli2在五组之间对比SMO-RNAi37304-1抑制组中有统计学意义减少到0.3702±0.024,近1/3。（P<0.05）。结合Western blot检测结果,基本一致。细胞生物学特性检测:细胞形态:空白组,阴性对照病毒组,LV-SMO15570-2（过表达）组细胞形态未发生明显改变,LV-SMO-RNAi37304-1（抑制组）,载体感染后CD24+CD44+细胞,可见细胞连接松散,细胞形态发生改变,伪足明显减少。表面标志物检测:结果显示经LV-SMO-RNAi37304-1（抑制组）慢病毒表达载体感染后的SW1990 CD24+CD44+的胰腺癌细胞,细胞CD24、CD44表达量明显减少。增殖能力检测:MTT细胞增殖测定结果:空白组为:0.705±0.108、0.969±0.067、1.938±0.690、2.222±0.385、3.136±0.926;CON238为:0.724±0.038、1.003±0.048、1.482±0.394、1.838±0.219、3.417±0.688;CON077为:0.819±0.147、1.015±0.244、1.253±0.326、1.893±0.355、3.549±0.399;LV-SMO15570-2为:0.830±0.158、0.773±0.033、1.209±0.540、1.400±0.228、2.373±0.426;LV-SMO-RNAi37304-1为:0.681±0.146、0.800±0.010、1.402±0.080、1.973±0.346、3.033±0.842。细胞迁移能力:胰腺癌细胞划痕第一个12小时愈合面积空白组:67.61±5.02%;CON238阴性病毒对照组:55.00±10.06%;CON077阴性病毒对照组:53.35±2.98%;LV-SMO15570-2过表达组:39.11±10.81%;LV-SMO-RNAi37304-1抑制组:25.92±5.19%;24小时愈合面积空白组:100%;CON238阴性病毒对照组:100%;CON077阴性病毒对照组:100%;LV-SMO15570-2过表达组:100%;LV-SMO-RNAi37304-1抑制组:53.59±14.40%;)结论:1.SW1990,BxPC-3、和Panc-1,3个胰腺癌细胞株中表面抗体CD24CD44阳性细胞的表达率SW1990最高,具有肿瘤干细胞的生物学特性,可分选后做实验目标细胞。2.针对Hh信号通路关键基因Smo设计了sRNA片段,成功构建了携带这个片段的载体慢病毒,通过感染SW1990CD24CD44阳性细胞后对Smo表达做分析,说明本实验的关于关键基因Smo设计的RNA片段功能性是成功的。3.荧光定量RT-PCR结果及Western blot法检测结果均提示,过表达组及抑制组对比空白组及阴性对照组Smo表达量明显改变,在Smo表达量改变的同时,抑制组Gli1、Gli2的表达量也受到影响而减少。同样抑制组肿瘤细胞在生物学特性上均发生明显的变化,表现为生长抑制和生物活性降低,这无疑证实了Hh信号通路在胰腺癌细胞恶性生物特性维持过程中的重要作用,也为针对Hh信号通路靶向基因干扰的方法来治疗胰腺癌提供了一定的实验基础及依据。